绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

双峰驼精液成分和品质的评价

应用紫外分光光度计扫描2峰精液品质和成分不同公驼精清的结果表明,正常精清出现19个蛋白和多肽组分,而品质不良的公驼精清仅为13个吸收峰;两者在碱性蛋白、酸性蛋白组分以及诱导排卵因子(OIF)的浓度和成分上,均存在明显的差别.     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

猪瘟标记疫苗的研究进展

猪瘟 (Classicalswinefever ,CSF)是世界范围内猪的最严重的疾病之一 ,因而被OIE列为A类传染病 ,其病原为猪瘟病毒 (CSFV)。CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属 (Pestivirus)中的 1个成员 ,属有囊膜的RNA病毒 ,基因组为单股正链RNA ,含有 1个大的开放性阅读框 (openreadingframe ,ORF) ,ORF两侧分别是 5′ 非翻译区 (5′ UTR)和3′ 非翻译区 (3′ UTR)。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由ORF所编码 ,翻译成 1个含 3898个氨基酸的多聚前体蛋白 ,这一大型前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异的蛋…     

口蹄疫病毒12S抗原免疫学性质的研究

用口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）Ａ型１２Ｓ基础免疫，Ｏ型１２Ｓ加强免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，筛迭，得到了一组群特异性单抗。用ＲＰＨＩ，ＡＧＤ，ＥＬＩＳＡ及阻断式和竞争式ＥＬＩＳＡ分析这组单抗得出以下结论：１２Ｓ抗原至少存在一个１２Ｓ独有的型间交叉的群特异性抗原表位，该表位是非中和性抗原表位，免疫原性较低；这组群特异性单抗可与ＦＭＤＶＯ，Ａ，Ｃ，Ａｓｉａ－１型１２Ｓ发生不同程度的反应，表明该表位存在于ＦＭＤＶＯ，Ａ，Ｃ，Ａｓｉａ－１型１２Ｓ上，但不同血清型的１２Ｓ表位构成存在细微的差别     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3''''非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列.测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基.经与参考毒株进行序列比较,结果显示, HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%.同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较.结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域.     

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。