犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

为分离犬细小病毒(canine parvovirus,CPV),用疑似犬CPV感染的病犬肠组织研磨液接种猫肾细胞(CRFK),进行病毒分离,并利用常规病毒学和分子生物学方法以及动物回归试验鉴定分离的病毒,并对其VP2基因序列进行测定及分析。结果显示,该病毒能在CRFK细胞上良好生长并产生细胞变圆、脱落等特征性细胞病变;细胞培养物能扩增出CPV的特异性基因组;对病毒的VP2基因序列和推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,本研究的分离毒株属于New CPV-2a型,与CPV SH-2/2011株的亲缘关系最近,其核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.83%和100%。上述结果表明,成功分离到1株New CPV-2a型犬细小病毒,将其暂命名为SH14株。本研究结果为进一步研究我国犬细小病毒的进化和变异,以及疫苗的研制奠定了物质基础。     

樱桃谷肉鸭源细小病毒QH-L01株的分离鉴定及VP1基因序列分析

2016年4月,四川邛崃某鸭场送检30只樱桃谷肉鸭,临床表现鸭喙变短、舌头伸出。从送检鸭脏器中分离鉴定出1株鸭源细小病毒,命名为QH-L01株。为进一步了解该病毒毒力及分子生物学特性,对其进行ELD50测定、VP1基因测序,并与其他细小病毒毒株进行比较。ELD50测定结果为10-6.54ELD50/0.2 m L;VP1核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,该病毒结构基因全长2 203 bp,编码734个氨基酸,与鹅细小病毒核苷酸同源性为92.8%~99.8%,与番鸭细小病毒同源性为77.4%~87.3%;VP1编码的氨基酸同源性和鹅细小病毒及番鸭细小病毒分别为95.2%~99.5%和85.4%~91.1%。VP1基因进化分析显示,该病毒和鹅细小病毒SYG26-35分离株处于同一进化分支上。动物回归试验结果显示,试验组出现明显的鸭源细小病毒BADS症状,对照组无明显变化,表明该病毒分离鉴定成功。     

猫杯状病毒GX2019的分离鉴定及全基因克隆遗传进化分析

从南宁某宠物医院疑似感染猫杯状病毒（Feline calicivirus,FCV）猫鼻咽拭子中,利用F81细胞分离1株FCV后,RT-PCR和电镜鉴定,测定TCID_(50)和理化性质。同时利用RT-PCR分段扩增病毒全基因序列,进行同源性及遗传进化分析。结果显示,FCV GX2019分离株的TCID_(50)为1×10~(-8.67)/0.1mL,基因组全长为7687 bp,与FCV CH-JL4（长春株）毒株核苷酸序列相似性最高,为85.3%,属于同一分支。氨基酸分析表明,与国内FCV疫苗株255、国外FCV疫苗株F9、FCV跛行综合征株2280及FCV GX01分离株氨基酸变异率分别为46.7%、26.7%、53.3%、40.0%,其中B细胞抗原识别表位中氨基酸位点发生了改变。     

猫杯状病毒GX2019的分离鉴定及全基因克隆遗传进化分析

从南宁某宠物医院疑似感染猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)猫鼻咽拭子中,利用F81细胞分离1株FCV后,RT-PCR和电镜鉴定,测定TCID_(50)和理化性质。同时利用RT-PCR分段扩增病毒全基因序列,进行同源性及遗传进化分析。结果显示,FCV GX2019分离株的TCID_(50)为1×10~(-8.67)/0.1 mL,基因组全长为7 687 bp,与FCV CH-JL4(长春株)毒株核苷酸序列相似性最高,为85.3%,属于同一分支。氨基酸分析表明,与国内FCV疫苗株255、国外FCV疫苗株F9、FCV跛行综合征株2280及FCV GX01分离株氨基酸变异率分别为46.7%、26.7%、53.3%、40.0%,其中B细胞抗原识别表位中氨基酸位点发生了改变。     

一株塞内卡病毒的分离与鉴定

2018年11月,河南南阳地区某养殖场发生了猪水疱病,经实验室检测确诊为塞内卡病毒(SVV)感染。选择SVV检测阳性的临床样品,处理后接种PK-15细胞,经多次传代培养,成功分离到1株塞内卡病毒,命名为HeNNY-1/2018株,并在PK-15细胞上对该毒株进行了空斑纯化和生长曲线的绘制。为进一步研究其遗传进化特点,采用RT-PCR技术扩增了其全基因组序列,并分别构建了基于VP1基因和全基因组的系统进化树。结果表明,分离株HeNNY-1/2018在感染后第24小时病毒效价最高为10~(7.6)TCID_(50)/m L。基因组核苷酸同源性分析显示,分离株HeNNY-1/2018与我国广西分离毒株GXHZH-1和美国毒株KS15-01呈现较高的核苷酸同源性,分别为98.0%和98.7%。进一步分子进化树分析显示,该毒株与2018年报道的广西地区的毒株处于较近的进化分支,而与我国早年间分离得到的其他毒株亲缘关系较远。本研究为河南地区塞内卡病毒流行状况提供了新的证据,也为下一步研究该病的诊断和防控提供了有力支撑。     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

犬瘟热病毒PS株的全基因组序列测定与遗传进化分析

对犬瘟热病毒(CDV)PS株基因组进行全基因组序列测定与分析,以阐明该毒株的基因特征与遗传进化情况。利用RT-PCR方法分段扩增PS株全基因组序列,分别将产物克隆入pMD18-T载体中并进行测序,将所测序列拼接获得CDV PS株的全基因组cDNA。用DNAStar软件比较PS株全基因组序列与国内外犬瘟热病毒疫苗株和野毒株全基因组序列的同源性,然后用Mega4.0软件进行系统进化分析。测序结果显示,PS株全基因组序列的长度为15 690nt,该基因组推导的某些氨基酸位点发生了突变。与GenBank中登录的国内外参考毒株的同源性比较结果显示,PS株基因组与MKY-KM08分离株的基因序列同源性高达97.9%,与其他毒株的同源性为93.0%～97.0%;与CDV3疫苗株和Onderstepoort疫苗株的同源性最低,分别为93.2%和93.0%。基于全基因组序列绘制的系统进化树表明,所有CDV分离株分为疫苗株和野毒株2支,PS株和MKY-KM08株位于同一支,属于亚洲1型。结果表明PS株为野毒株,其全基因组序列与MKY-KM08株的全基因组序列亲缘关系最近。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及其基因组变异特征的研究

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在河南省新乡地区猪体内的进化情况,笔者对河南省新乡地区某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料进行了病毒的分离鉴定,并采用PCR扩增得到了该病毒的全基因组序列,同时对分离病毒株的GP5和NSP2序列进行了比对分析。结果显示:成功分离并鉴定出1株美洲型PRRSV(XX2015),与中国代表毒株CH-1a中的核苷酸同源性是92.8%,与高致病性(HP)-PRRS病毒代表株Hu N4、Hu B1、He Nan-1、He NAN-A14株的核苷酸同源性则分别为97.2%、97.0%、97.2%、94.4%。对基因组的进一步分析表明,该毒株GP5蛋白非中和性表位处存在氨基酸变异,NSP2蛋白在第481位、第485~488位、第533~561位共缺失34个氨基酸。XX2015分离株是HP-PRRSV的一个代表株,该病毒株在NSP2蛋白中存在跳跃性突变,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子进化提供了分子证据。     

三株传染性法氏囊病病毒超强毒株全基因组的克隆与序列分析

为了获得本实验室3株(HuB-1、HeB10XS02、SD10LY01)传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株的全基因组序列,并了解其序列特征,首先测定了这3株毒株对SPF鸡的致死率,然后利用融合PCR技术扩增获得全基因组序列,对其进行遗传进化分析。结果显示,3株毒株对SPF鸡的致死率均在60%以上,为IBDV超强毒株(vvIBDV)。遗传进化分析表明,3株分离毒株的A节段均位于超强毒分支。IBDV的B节段分为明显的3个亚群,其中HuB-1、SD10LY01的B节段属于第Ⅲ亚群,HeB10XS02的B节段则属于第Ⅱ亚群。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群之间在VP1蛋白上存在17个保守氨基酸差异位点,其中第145~147位氨基酸形成独特的"三联体"基序,不同亚群具有不同的基序。本研究结果为更好地了解vvIBDV基因组特征以及致病性分子基础的研究提供了重要理论依据。     

14株基因C型鸭甲肝病毒分离株的VP1基因变异及其编码蛋白的抗原表位分析

对14株分离自四川不同地区的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1基因进行了PCR扩增、测序、序列比对分析以及抗原表位分析。结果显示,14株DHAV-C VP1基因核苷酸序列的同源性为92.2%～100%,推导氨基酸序列的同源性为85.8%～100%,与GenBank中的24株DHAV-C VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.9%～99.3%和80.8%～100%。聚类分析显示,四川华阳地区分离的6株DHAV-C的VP1基因与黑龙江分离株Du/CH/LJS/090905同属一支,3株四川邛崃地区分离株与北京分离株C-GY及福建分离株FJ01同属一支,4株四川郫县分离株与1株四川邛崃分离株处于独立的小分支,它们与其他毒株之间存在一定的遗传距离。DHAV-C VP1蛋白由240个氨基酸组成,是由α螺旋、β折叠和无规则卷曲共同组成的混合型蛋白,VP1蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面可及性均较高,其中212～222位氨基酸区域的亲水性、抗原指数和表面可及性最高,可能是DHAV-C VP1蛋白上的B细胞表位优势区域,为DHAV-C表位疫苗的研究提供了理论依据。结果表明,四川分离株可能由于引种等原因从全国不同地区进入四川境内。     

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒的系统进化和分子遗传特征分析

为了解在江苏某湿地野生水禽中分离到的1株禽流感病毒的来源、流行特点、进化和分子遗传特征,将采集的野生水禽粪便经处理后,使用A型禽流感通用荧光RT-PCR检测,阳性样品接种10日龄SPF鸡胚,收取接种后第24~96小时的尿囊液,进行血凝试验,随后对其进行全基因测序和遗传进化分析。结果显示,该毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)。HA蛋白的裂解位点氨基酸序列为PEKQTR↓GLF,无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;HA与NA的糖基化位点没有发生突变;NA耐药性氨基酸位点出现突变位点;PB2蛋白第627和701位氨基酸分别为谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asn),是禽源流感病毒的特征性氨基酸。在Gen Bank中对该毒株进行序列比对分析,结果显示,与所测基因片段同源性最高的10株毒株基本位于我国东部候鸟迁徙路线上。结果表明,A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)株为从江苏分离的低致病性禽流感病毒,基因主要来源于我国东部候鸟迁徙路线上的禽流感病毒。     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

犬细小病毒SH15株的分离鉴定与全基因组分析

为了解上海地区犬细小病毒的流行及其变异情况,从疑似犬细小病毒感染的死亡犬采集各种组织,无菌处理病料后同步接种F81细胞,盲传至第5代出现细胞病变,从肠组织中分离出1株病毒。采用电镜进行病毒形态学观察,以及HA、HI和PCR等方法鉴定病毒,结果证实为犬细小病毒,命名为CPV-SH15。该病毒的血凝效价为2~9,病毒TCID_(50)为10~(5.2)/m L,测得病毒编码区基因序列的全长为4 869 bp,与上海分离毒株CPV/CN/SH1/2013的同源性为99.8%,亲缘关系较近,说明上海地区的犬细小病毒的遗传变异并不明显。对其VP2基因的氨基酸序列进行分析,确定该细小病毒属于New CPV-2a亚型。该研究为犬细小病毒遗传进化的进一步研究奠定了基础,从而为犬细小病毒病疫苗的研制以及防控提供参考。     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

猪非典型瘟病毒GX01-2018株全基因组分子特征的分析

猪非典型瘟病毒(APPV)被证实是新生仔猪先天性震颤的致病因子。为了解广西APPV流行毒株的分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增APPV阳性病料,经克隆、测序、拼接,获得1株APPV的全基因序列,遂被命名为GX01-2018株。结果显示,GX01-2018株基因组全长11 565 bp,包括一个编码3 635个氨基酸的阅读框(ORF)。同源性分析显示,GX01-2018株与国内代表毒株广西GX-CH_2016株、江西JX-JM01-2018A01株、广东China/GD-SD/2016株、广东GD株核苷酸序列的同源性分别为98.2%、92.9%、83.4%、90.8%。GX01-2018株与国外代表毒株美国000515株、德国Bavaria_S5/9株、奥地利AUT-2016_C株、荷兰NL1株核苷酸序列的同源性分别为87.8%、90.7%、90.5%、90.7%。上述国内外代表毒株间Npro、Erns、E2基因核苷酸序列的同源性分别为79.1%～97.2%、83.0%～98.4%、83.1%～96.8%。基于APPV全基因组以及E2、Npro、Erns基因核苷酸序列绘制遗传进化树,获得相似的进化树图。来自广西的GX01-2018株与欧洲型毒株位于一个分支,而同样来自广西的GX04/2017株与美洲型毒株位于另一个分支。表明APPV流行毒株具有遗传多样性,来自同一地区的流行毒株出现较大的遗传变异。     

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

猫细小病毒广西株的分离鉴定及动物发病模型的建立

本研究通过利用FK81细胞按常规方法对猫细小病毒进行分离鉴定。选取其中效价最高的分离株以不同剂量经口腔和鼻腔感染猫,通过测定LD_(50),观察临床症状、白细胞含量变化、组织病理变化等指标,构建动物发病模型。从86份疑似猫瘟粪便样品中成功分离到6株猫细小病毒,其中GX01株TCID_(50)及血凝价均高于其他5株;不同剂量GX01感染猫后均表现出高热、腹泻、呕吐和体重下降等典型临床症状;感染后第3天粪便中检测到病毒;发病后期白细胞严重减少;攻毒第14天测定LD_(50)为1×10~(-2).2;解剖表现为肠臌气、部分脏器肿大有出血点;组织病理切片观察到十二指肠和肺上皮细胞出现胞浆、胞核侵染、坏死等明显的组织病变,肾出现脂肪变性。本研究成功分离6株广西地区猫细小病毒并建立发病动物模型,为猫细小病毒发病机制和治疗药物的研究奠定了基础。     

甘肃犬瘟热病毒流行株N蛋白和H蛋白基因的序列分析

采用RT-PCR方法扩增了3株犬瘟热病毒(CDV)分离株的N、H蛋白基因,将其克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析。结果表明,获得的N蛋白基因序列与GenBank上登录的其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为92.5%～99.9%,获得的H蛋白基因与其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为81.7%～100%。由N蛋白基因和H蛋白基因推导的氨基酸序列构建的遗传进化树可知,这3株CDV流行株均处于野毒株的分支上,在N蛋白基因的遗传进化树上,CDV流行株呈现明显的地域性差异,而在H蛋白基因的遗传进化树上,不同国家和地区的CDV分离株之间虽有一定的地域联系,但与N蛋白基因相比,其地域性联系并不明显。说明这3株CDV流行株为野毒株,H蛋白基因的变异水平明显高于N蛋白基因,而N蛋白基因更能显示毒株与地域的关系。