三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

为分离犬细小病毒(canine parvovirus,CPV),用疑似犬CPV感染的病犬肠组织研磨液接种猫肾细胞(CRFK),进行病毒分离,并利用常规病毒学和分子生物学方法以及动物回归试验鉴定分离的病毒,并对其VP2基因序列进行测定及分析。结果显示,该病毒能在CRFK细胞上良好生长并产生细胞变圆、脱落等特征性细胞病变;细胞培养物能扩增出CPV的特异性基因组;对病毒的VP2基因序列和推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,本研究的分离毒株属于New CPV-2a型,与CPV SH-2/2011株的亲缘关系最近,其核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.83%和100%。上述结果表明,成功分离到1株New CPV-2a型犬细小病毒,将其暂命名为SH14株。本研究结果为进一步研究我国犬细小病毒的进化和变异,以及疫苗的研制奠定了物质基础。     

犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

犬细小病毒SH15株的分离鉴定与全基因组分析

为了解上海地区犬细小病毒的流行及其变异情况,从疑似犬细小病毒感染的死亡犬采集各种组织,无菌处理病料后同步接种F81细胞,盲传至第5代出现细胞病变,从肠组织中分离出1株病毒。采用电镜进行病毒形态学观察,以及HA、HI和PCR等方法鉴定病毒,结果证实为犬细小病毒,命名为CPV-SH15。该病毒的血凝效价为2~9,病毒TCID_(50)为10~(5.2)/m L,测得病毒编码区基因序列的全长为4 869 bp,与上海分离毒株CPV/CN/SH1/2013的同源性为99.8%,亲缘关系较近,说明上海地区的犬细小病毒的遗传变异并不明显。对其VP2基因的氨基酸序列进行分析,确定该细小病毒属于New CPV-2a亚型。该研究为犬细小病毒遗传进化的进一步研究奠定了基础,从而为犬细小病毒病疫苗的研制以及防控提供参考。     

藏獒源犬细小病毒的分离鉴定

为弄清犬细小病毒(CPV)在藏獒中的流行情况,将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠棉拭子8份处理后接种猫肾传代细胞(F81细胞),分离到6株病毒,对其进行了血凝试验(HA)、半数组织培养物感染剂量(TCID50)的测定,理化性质鉴定,提取分离株DNA并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其一特异性片段和VP2全序列,并与GenBank上登录的CPV毒株进行比对。结果表明,接毒后第6～13天在F81细胞上出现了明显的细胞病变(CPE),表现为细胞融合、变圆或拉长;所得分离株能使猪红细胞发生凝集反应,血凝效价为27～211;能抗酸(pH3)、热(60℃)、200mL/L乙醚、480mL/L氯仿;从细胞培养物中分别扩增出与特异性片段825bp一致以及与VP2全基因1 755bp一致的条带。将扩增的VP2序列与GenBank上登录的HQ883267.1、FJ222823.1、FJ005214.1等10个国内外CPV分离株的VP2序列进行比对;结果显示,与北京地区一分离株(HQ883267.1)的同源性最高,为99.0%～99.6%。所得分离株为不同毒株,但均为CPV-2a型。     

犬细小病毒兰州分离株VP2基因的克隆及进化树分析

本研究首次对地处西北地区的兰州的犬细小病毒分离株(命名为CPV/LZ-kbz11)进行了VP2基因克隆、测序,并与参考株、我国各地区流行株以及周边国家流行株进行了进化树分析和核苷酸同源性比较。结果显示,该毒株能在犬肾细胞系(MDCK)上成功生长,但不引起细胞病变。该分离株为CPV-2b亚型毒株,与M19296(CPV-2亚型参考毒株)、EU659118(CPV-2a亚型参考毒株)、EU145954(CPV-2b亚型参考毒株)、AB054224(CPV-2c亚型参考毒株)的核苷酸序列同源性分别为99.0%、99.3%、99.2%、99.2%;与我国及周边主要流行毒株EU213079(CPV-2a,浙江)、EF666059(CPV-2a,北京)、EF599096(CPV-2a,韩国)、EF592511(CPV-2a,台湾)、EU483512(CPV-2b,浙江)、FJ222821(CPV-2c,意大利)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.4%、99.4%、99.4%。对VP2基因中非同义置换的氨基酸分析结果显示,兰州分离株与对比毒株的非同义突变位点共有4处,分别在第267位、324位、426位和440位的氨基酸处。     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

猫细小病毒广西分离株FPV-GX01全基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西地区猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的生物学特性,阐明其基因组与遗传进化等特征。笔者采集经胶体金检测FPV阳性的粪便样品接种FK81细胞,进行病毒分离及理化特性鉴定,同时利用PCR分段扩增病毒基因组DNA,并与国内外分离株进行同源性及遗传进化比较分析。结果显示,分离株在FK81细胞上盲传3代后出现CPE,猪红细胞血凝价达1∶1 024,第5代病毒TCID50测定为10-5.2/0.1 m L,该毒株对热、酸、氯仿及乙醚有较强的抵抗力,将分离株命名为FPV-GX01。全基因测序结果表明,分离株基因组为4 901 bp,与2007年我国猫源细小病毒株FPV-XJ1同源性高达99.0%,属同一分支。氨基酸位点分析显示,FPV-GX01株VP2蛋白功能较少发生突变,与犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)氨基酸位点存在宿主差异;FPV-GX01 NS1蛋白序列上没有VP2蛋白稳定,第619位异亮氨酸突变成苯丙氨酸。广西地区分离的猫细小病毒也在不断发生遗传变异进化,本研究对该地区猫细小病毒的进化特征提供了一定的参考。     

J亚群禽白血病病毒Hrb-1和JL-2株囊膜基因的克隆及遗传分析

采用特异性检测J亚群禽白血病病毒的RT PCR方法 ,自哈尔滨市及吉林省患病鸡群中分离鉴定出 2株J亚群禽白血病病毒 ,分别命名为Hrb 1和JL 2。 2株病毒经SPF鸡胚成纤维细胞增殖 ,获取其前病毒DNA。采用依据原型毒株HPRS 10 3cDNA序列设计并合成的 1对引物 ,进行PCR扩增 ,得到了JL 2和Hrb 1的囊膜基因。分别构建了重组质粒 pMD18 T JL2 /env和pMD18 T Hrb 1/env。在对 2株病毒囊膜基因进行序列测定的基础上 ,将囊膜基因中 gp85和 gp37的核苷酸序列及其推导氨基酸序列与国际上不同的参照毒株以及国内部分分离株进行了比较分析 ,结果表明 ,JL 2和Hrb 1分别与美国病毒株adol hc 1和UD3有着较大的亲缘关系。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒(CPV)VP2蛋白基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET-30a载体中,构建了原核表达载体pET-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白,Western-blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15.8 ng/孔,血清的最佳稀释倍数为1∶100,建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

犬瘟热病毒SD(14)7株对比格犬的致病性研究

对3~4月龄比格犬经肌肉注射方式接种犬瘟热病毒(CDV)SD(14)7株1 mL(病毒含量为106.0 TCID50/mL),并进行体温、淋巴细胞数、眼鼻直肠排毒和组织病毒含量及分布等指标检测,评价变异株SD(14)7对比格犬的致病水平。结果显示,CDV感染后第2天比格犬出现CDV感染的典型特征,如眼和鼻分泌物增多,淋巴细胞明显减少,然而动物的体温变化无明显的“双相热”特征。CDV定量检测结果显示,比格犬攻毒后第10天开始通过眼鼻和直肠向外界排毒,CDV在脾中含量最高。病理剖检可见脾有坏死、肺炎症出血等,病理组织HE和免疫组织化学检测发现脾有严重的充血,淋巴细胞中有CDV抗原,证实该毒株主要感染淋巴组织和器官。此外,比格犬大脑部分神经细胞严重肿胀,在脑中可检测到CDV,表明SD(14)7株具有一定的神经嗜性。本试验结果为进一步鉴定犬瘟热病毒感染比格犬的毒力因子和免疫原性以及疫苗免疫效果的评价奠定了基础。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及其N基因片段的克隆和测序

通过形态学观察、动物回归试验、鸡胚接种试验、病毒干扰试验以及血凝试验分离鉴定了1株肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。在透射电子显微镜下,病毒粒子多呈球形,直径为80~120 nm,有囊膜,表面有冠状突起。鸡胚连续盲传至第 1~2 代,开始出现死亡或出现侏儒胚;分离株可显著干扰NDV在鸡胚中的增殖;病毒尿囊液无凝血活性,但经5 g/L胰蛋白酶处理后,能够凝集10 mL/L的鸡红细胞。利用RT PCR技术对分离株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析比较,证实分离株为肾型IBV,命名为AH3 04株。     

貉源犬腺病毒Ⅰ型的分离鉴定及生物学特性分析

用MDCK细胞从患病貉的临床样品中分离出1株病毒,并采用PCR、测序分析、免疫荧光试验、血凝试验和理化特性试验进行鉴定。结果显示:PCR扩增得到500 bp条带,其核苷酸序列与犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)同源性为93.2%～98.7%,而与CAV-2同源性仅为55.3%;接种该病毒的MDCK细胞出现了"葡萄串样"细胞病变(CPE),且胞核中有特异性亮绿色荧光;病毒滴度为1×107.4TCID50/m L;该病毒可以凝集人O型红细胞和豚鼠红细胞;对FUDR敏感,对乙醚、热、酸有一定的抵抗力。以上结果表明,本研究分离的病毒为貉源CAV-1。为了解CAV-1对貉的致病性和疫苗开发提供了依据。     

用聚合酶链反应检测犬传染性肝炎的研究

应用聚合酶链反应(PCR)对人工感染犬传染性肝炎病毒(ICHV)的犬进行定期尿检,并以血凝和血凝抑制试验及病毒分离进行比较.结果证明,用PCR方法可以快速检出排毒的犬,其灵敏度是血凝效价的上百倍.     

犬细小病毒2b亚型VP2基因的克隆及其B细胞抗原表位分析

对犬细小病毒2b亚型衣壳蛋白VP2基因进行了克隆、测序,并用分子生物学软件DNAStar对VP2基因的推导氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,获得了犬细小病毒2b亚型的VP2基因,序列全长1 755 bp,编码584个氨基酸;B细胞表位主要位于VP2蛋白第1~38、73~83、86~104、152~195、235~243、294~326、347~400、404~416、469~483、503~521和571~585区段。表明,犬细小病毒2b亚型VP2蛋白上分布有多个B细胞抗原表位,这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

犬呼肠孤病毒1型BJ-JB-3株的分离鉴定

从临床表现呼吸道症状的病犬血液中分离获得了1株病毒,采用细胞培养、血凝及血凝抑制试验、中和试验、免疫电镜观察、免疫荧光抗体试验进行了鉴定.结果显示,该病毒能使MDCK和Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),能凝集人O型红细胞和猪红细胞;能被呼肠孤病毒1型血清所中和,病毒粒子呈圆形,有实心和空心两种粒子,将感染细胞用抗呼肠孤病毒1型血清及荧光抗体染色后见明显的绿色荧光.表明,所分离的病毒为呼肠孤病毒1型.     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。