大鲵蛙病毒US22家族基因的TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了进行大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)的早期诊断,以US22家族基因作为靶基因,建立大鲵蛙病毒Taq Man MGB实时荧光定量PCR检测方法,同时对该方法进行特异性、敏感性、重复性评估,并对73份未知大鲵血液样品进行检测。结果显示,标准曲线在所选浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.997;该方法对大鲵蛙病毒的检测有高度特异性,与其他8种病毒或细菌之间均无交叉反应;灵敏性良好,能检测到2.00×101copies/L的标准品浓度,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复的变异系数均小于2%,重复性好;在73份未知样品检测中,Taq Man MGB实时荧光定量PCR能够检测到更低浓度的病毒,较常规PCR的敏感性更佳。鉴于该方法快速、特异、敏感、可重复、可定量的优点,对大鲵蛙病毒早期潜伏感染的快速诊断具有重要意义。     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

副溶血性弧菌LUXTM荧光PCR快速检测方法的建立

根据LUXTM荧光PCR技术原理,针对副溶血性弧菌toxR基因的保守序列,设计了特异的LUXTM荧光标记引物,通过优化反应条件与参数,建立了可快速检测副溶血性弧菌的LUXTM荧光PCR方法。结果显示,该方法高度敏感,对纯菌的检测低限达到每个反应体系7个菌(CFU),经6 h增菌培养后检测,对样品的检测低限(CFU)达到100/25 g;特异性强,对副溶血性弧菌2株标准菌株和10株参考菌株的检验均呈阳性,而对霍乱弧菌等28株非目标菌的检测均呈阴性;重复性好,定量检测的批内和批间变异系数均小于1%。应用此方法检测水产样品103份,检出阳性样品6份,与TaqMan荧光PCR和SN标准的检测结果完全一致。用此方法可在8 h内完成对样品中副溶血性弧菌的检测,其检测的快速性、敏感性和特异性与TaqMan荧光PCR技术相当,但检测成本更低。     

沙门菌和副溶血性弧菌双重荧光PCR快速检测方法的建立

根据沙门菌invA基因和副溶血性弧菌toxR基因的保守序列设计引物和探针,通过优化反应条件与参数,建立了可同时检测沙门菌和副溶血性弧菌的双重荧光PCR方法.结果显示,该方法敏感度高,特异性强,重复性好.对沙门菌和副溶血性弧菌的检测低限均低于每反应体系10CFU,经对29株非目标菌进行检测均呈阴性,而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%;应用该方法检测人工染菌样品和实际样品,结果与SN标准方法的检测结果一致;应用该法可在8h内完成对样品中沙门菌和副溶血性弧菌的同步检验.     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）实时荧光PCR检测方法，本研究根据ASFV CD2v基因序列，设计了TaqMan荧光PCR引物及探针，通过优化退火温度、引物及探针的比例，建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明，本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性，以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系，相关系数为0.988，斜率为 －3.025 4，最低检测限可达到10 copies/μL，且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好，批内和批间变异系数均小于2%。综上，本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

五种重要致病性弧菌高通量液相芯片检测方法的建立

为建立一种快速、准确同时检测5种致病性弧菌的高通量液相芯片技术,本研究针对霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌的10个目的基因,包括5个种特异性基因和5个毒力基因,分别设计特异性引物和探针,多重PCR扩增后的产物与偶联有不同核酸探针的微球混合物进行杂交反应,利用液相芯片检测仪分析结果。结果显示,本方法同时检测这5种致病性弧菌时,检出限最高达到1.8×10~2 CFU/mL;检测包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、河流弧菌、沙门菌、李斯特杆菌和铜绿杆菌等常见细菌时,均无交叉反应,表明特异性好;检测不同批次的样品时,变异系数均小于8%,表明重复性良好。本研究建立的液相芯片检测方法能够快速同时检测这5种致病性弧菌,具有高通量、灵敏性高、重复性好、可控性强、节省样本和时间等优点,对水产品中多种重要致病性弧菌的检测和流行病学调查提供了技术支持。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为-3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法.用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性.应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、14、21 d分别采集全血,检测结果均为阳性.证实,本试验所建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株.     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针,建立了快速检测沙门茵的实时荧光定量方法,并对反应条件进行了优化,组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测,该试剂盒的检测灵敏度达4．5 CFU(25μL反应体系),比常规PCR高100倍,而且稳定性良好,至少可以冷冻保存9个月。结果表明,所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点,适于大量样品的检测。     

鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为鼠源VCAM-1基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测鼠源VCAM-1基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.998;灵敏性、重复性及特异性均较高。可用于鼠源细胞中VCAM-1基因的定性鉴别和含量测定。结果表明,成功建立了一种快速准确检测鼠源VCAM-1基因的TaqMan实时荧光定量PCR法。     

泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为泛素基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中公布的泛素基因序列设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测泛素基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法的线性关系好,以质粒标准品构建的标准曲线的相关系数r~2为0.999;灵敏性、特异性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检测出不同类型细胞中泛素的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测泛素TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种灵敏性高、特异性强的检测绵羊肺炎支原体的TaqMan实时荧光定量PCR方法。根据GenBank上已发表的绵羊肺炎支原体HSP70基因序列设计引物和探针,构建标准阳性质粒,建立实时荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法标准曲线的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=1.000,斜率S=-3.334,扩增效率E=99.5%;敏感性高,可以检测出的最低样品浓度为1×101copies/L,是普通PCR的100倍;特异性强,能有效区分巴氏杆菌等9种病原;重复性好,组内、组间的Ct值变异系数均小于2%。运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法可简便、准确地鉴定绵羊肺炎支原体。     

猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种高效准确检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的实时荧光定量PCR方法,以FIPV N基因为靶基因设计特异性探针和引物,构建质粒标准品。通过优化反应条件,建立real-time PCR方法,并进行临床检测。经方法优化,所建立方法的标准曲线为y=-3.137x+42.243,R²值为0.999,扩增效率E为108.0%。该方法与猫瘟病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)无交叉反应,特异性良好;检测最低拷贝数为9.250 copies/μL,比常规PCR方法高出100倍;组内、组间变异系数均小于5.0%,重复性好。采用建立的方法和EvaGreen real-time PCR方法对39份临床样品进行检测,结果,检出阳性样品数分别为24和22,经Kappa检验,两者高度一致。上述结果表明,本研究成功建立了高效、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,可用于FIPV的临床病例检测。     

牛冠状病毒牛肠病毒牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测牛冠状病毒（BCoV）、牛肠病毒（BEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光PCR方法并应用于临床检测,根据BCoV N基因、BEV 5′-UTR基因、BVDV 5′-UTR基因设计3对特异性引物和探针,通过对引物、探针的浓度以及反应条件的优化,建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法,并对该三重PCR方法的敏感性、重复性、特异性和临床样本检测结果进行了评价。结果显示,该方法灵敏度高,对BCoV、BEV和BVDV的最低检测限为10 copies/μL;重复性稳定,批内和批间变异系数（CV）均在2%以下;特异性强,对常见腹泻类病原无交叉反应。应用此方法检测河南省445份牛腹泻粪便样本,BCoV、BEV和BVDV的阳性率分别为6.5%(29/445)、17.5%(78/445)、12.1%(54/445)。上述结果表明,本研究建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒一步法三重实时荧光PCR方法,为疫病的快速检测及预防提供了有效的技术手段。     

丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法的建立

为建立高效快速的丹毒丝菌属荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据丹毒丝菌属16S r RNA基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准品浓度在1.06×106~1.06×101copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到1.06×10-2 copies/L的标准品阳性质粒;该方法与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等22种细菌和病毒无交叉反应;批内和批间的变异系数(CV)均小于3%。对临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

猪鼻支原体荧光PCR检测方法的建立和应用

为了建立猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）快速荧光PCR检测方法,本研究合成了该病原特异性基因P37的重组质粒,根据该基因设计荧光PCR引物和探针,并对设计的引物和探针的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法具有高度的特异性,除了识别猪鼻支原体基因组外,对猪的基因组和猪常见病原的基因组均不发生交叉反应。在敏感性和重复性试验中,该方法对猪鼻支原体的检测限为1 000copies/m L,变异系数小于3%,因此具有优良的敏感性和稳定性。用该方法检测临床样本,阳性检出率为76%(38/50),远高于普通PCR的阳性检出率（40%,20/50）。上述结果表明,本研究建立的荧光PCR方法在特异性、敏感性和稳定性方面均满足猪鼻支原体的临床检测要求,可以用于猪鼻支原体临床样品的检测。     

I群禽腺病毒SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计了1对引物,建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法.用Ⅰ群禽腺病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA,与鸡减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、传染性腔上囊炎病毒和传染性支气管炎病毒等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应,具有良好的重复性.对保存的3份Ⅰ群禽腺病毒的细胞培养物进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为1×106～1×108拷贝/μL.表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上Ⅰ群禽腺病毒感染的检测.     

以toxR-S为靶基因的副溶血弧菌PCR检测方法的建立

目前,副溶血弧菌PCR检测方法大多基于毒力基因或看家基因,存在假阳性和漏检的风险,建立敏感而特异的快速分子检测方法迫在眉睫。本研究在对toxRS基因序列进行系统发育树构建及同源性分析的基础上,发现toxR、toxS基因均有作为种特异性检测靶基因的可能,故分别设计引物Primers-R、Primers-S及Primers-R-S,通过优化PCR反应条件建立了相应的PCR检测方法。通过对57株副溶血弧菌和19株亲缘相近菌及食源性致病菌的检测,toxR-SPCR显示出较好的稳定性和特异性,检测极限达2pg基因组DNA。对359份市场海产品样品的比对检测结果表明,toxR-S PCR与国标(GB4789.7-2013)规定的方法的符合率高达95.82%,敏感性100%,特异性92.39%。对两种方法检测时阳性不一致的15份样品,以其总细菌DNA为模板扩增副溶血弧菌看家基因;测序比对结果显示,这15份样品与副溶血弧菌同源性高达97%以上。上述结果表明,本研究建立的toxR-S PCR具有快速、特异、敏感等优点,可被广泛用于副溶血弧菌的快速检测。     

牛轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速特异的定量检测牛轮状病毒的荧光定量PCR方法,本研究从牛轮状病毒NCDV株DNA中扩增的VP6基因片段(211 bp)并克隆于pMD19-T载体(p MD19-T-VP6)作为重组质粒标准品,建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果表明,VP6片段长211 bp,经鉴定所构建的重组质粒成功;用该质粒测得real-time PCR的最低检测量为15.39 copies/L。用该方法检测猪传染性胃肠炎病毒、牛细小病毒、猪流行性腹泻病毒及伪狂犬病病毒的结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的重复性。以上结果表明,本研究建立的基于VP6基因的牛轮状病毒qRT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等特点,可用于牛轮状病毒的早期诊断。