猪链球菌9型GZ0565株体外传代的生物学稳定性

选取猪链球菌9型(SS9)GZ0565株连续传代培养至20代(S1～S20代),用API20Strep生化鉴定试剂条和全自动生化分析仪对各代次之间进行了比较鉴定。生化试验结果表明,GZ0565株传代稳定性好。以特殊品系的黑色小鼠C57BL/6作为SS9感染的动物模型,经腹腔注射接种S1、S5、S10、S15和S20代不同稀释度菌液,统计1周内小鼠的死亡数量。结果显示,攻毒后死亡的小鼠具有典型的细菌性败血症病理变化,肝及脑内可分离到革兰氏阳性球菌,短链状,绵羊血平板上呈β溶血,经PCR检测,从死亡小鼠体内分离的细菌与攻毒菌株为同一种细菌。S1、S5、S10、S15和S20代菌株对小鼠的LD50分别为3.63×108、6.03×108、2.63×109、1.45×109和8.7×1010。证明SS9GZ0565株经过20代传代培养后毒力相对稳定,可作为疫苗候选株。     

天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×106CFU/m L,最大值为5.7×108CFU/m L;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、 fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、 37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×103～3.9×104CFU/m L,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

肠炎沙门菌感染ICR小鼠模型的建立

肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)是引起人类食源性疾病的重要革兰阴性菌之一,可引起禽、家畜等动物较为严重的感染症状。本研究为了建立肠炎沙门菌感染ICR小鼠模型,标准菌株SE 50336分别以1×10~8、1×10~7、1×0~6、1×10~5、1×10~4CFU/mL的剂量通过口腔灌注方式感染6周龄ICR雌鼠,每组10只,以接种PBS的10只小鼠作为对照组,测定肠炎沙门菌对ICR小鼠的半数致死量(LD_(50))。将40只ICR雌鼠随机分成两组,以测定的LD_(50)剂量接种肠炎沙门菌,通过临床症状、体重变化、组织病理学、组织中细菌载量以及TNF-α与IL-6表达水平评价肠炎沙门菌对小鼠的致病性。结果,标准菌株SE 50336对ICR小鼠的LD_(50)为1×10~(5.67)CFU/mL。感染后第3天,小鼠出现采食量下降、活动减少、皮毛色泽变暗、畏寒扎堆等症状;感染后第5天,小鼠的平均体重较对照组呈现下降趋势,后期开始恢复。组织病理学结果显示,肝脏出现灶状坏死,形成血栓,出现坏死细胞;脾脏先后出现纤维素性坏死性脾炎,白髓内淋巴细胞减少,呈小空泡状,出现坏死灶。菌落载量分析发现,细菌载量随着感染进程而升高,在脾脏中繁殖速度最快,载量也最高,肝脏次之。定量PCR结果显示,TNF-α表达水平呈升高趋势,而IL-6表达水平降低。上述结果表明,本试验成功建立了肠炎沙门菌标准菌株SE50336感染ICR小鼠的模型,为肠炎沙门菌感染与致病机制的研究提供了有价值的动物模型,也为表达抗菌肽转基因小鼠抗肠炎沙门菌的评价奠定了基础。     

2型猪链球菌动物致病性试验

用5株2型猪链球茵对BALB/c小鼠、猪、兔和普通小白鼠进行攻毒试验,其中SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠有致病性,其LD50分别为2.1×106、3.1×107、5.3×10 7、9.4×107,SS2-N株以2.8×108对BALB/c小鼠不致死.SS2-1株对猪有致病性,LD50为4.2×107,ID50为1.33×106,而以8×108活菌攻击对兔和普通小白鼠均未致病.表明2型猪链球茵可人工感染BALB/c小鼠和猪引起发病,2型猪链球菌MRP和EF毒力因子的表现型与其对BALB/c小鼠的致病性无相关关系,BALB/c小鼠可用作疫苗免疫试验的动物模型.     

猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性

2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌,均呈链球菌的特征形态,α溶血,生化试验结果相似,且都不与A~G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定,一株为猪链球菌2型,另一株为猪链球菌9型。2型分离株的3个毒力基因均为阳性(sly+epf+mrp+),但对小鼠的毒力较低,2/10小鼠在接种细菌后第6~15 d发病致死,细菌在小鼠中的带菌时间至少15 d;9型分离株3个毒力因子均阴性(sly-epf-mrp-),但对小鼠有较强毒力,9/10小鼠在接种细菌后5 d内发病死亡,对小鼠的半数致死量为1.70×106CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型,而且还有9型。     

猪链球菌2型动物致病性试验研究

选取猪链球菌2型SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7和SS2-N(国外引进)株,对BALB/c小鼠、猪、兔及普通小白鼠致病性进行试验.结果SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠半数致死量(LD50)分别为2.1×106、3.1×107、5.3×107和9.4×107,SS2-N株以2.8×108活菌对BALB/c小鼠不能致病;SS2-1株对猪LD50为4.2×107,对猪半数感染量(ID50)为1.33×106,用8.0×108活菌对兔及普通小白鼠感染均不能致病.提示猪链球菌2型人工感染可引起BALB/c小鼠和猪发病;其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外因子(EF)的表现型与对BALB/c小鼠的致病性无相关关系;BALB/c小鼠可用于猪链球菌(2型)病疫苗免疫试验的动物模型.     

两株乙型脑炎病毒的分离鉴定与生物学特性研究

2009年从四川多个地区的猪场采集流产死胎及库蚊样本12份,采用BHK-21细胞培养方法分离出2株乙型脑炎病毒,分别命名为JEV-CZ1与JEV-YA1,PrM/C基因与疫苗株SA-14-14-2的同源性分别为90.9%与99.6%,基因分型研究显示JEV-CZ1株为基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,JEV-YA1株为基因Ⅲ型。分离株在BHK-21细胞中能产生明显的细胞病变,其细胞半数感染量(TCID50)分别为10-6.206 TCID50/0.025mL与10-4.943 TCID50/0.025mL。经脑内注射测得分离株对体重9～11g小鼠的半数致死量(LD50)分别为9.97LD50/0.1mL和6.95LD50/0.1mL,其中JEV-CZ1株毒力较强。小鼠接种分离株3～4d后出现抽搐、肢体痉挛、异常兴奋等神经症状,5～7d后全部死亡,剖检可见脑部充血、水肿;病理切片观察可见脑内神经细胞变性坏死,其他器官也出现不同程度的病变。结果表明这2个分离株符合乙型脑炎病毒的特征。     

猫细小病毒广西株的分离鉴定及动物发病模型的建立

本研究通过利用FK81细胞按常规方法对猫细小病毒进行分离鉴定。选取其中效价最高的分离株以不同剂量经口腔和鼻腔感染猫,通过测定LD_(50),观察临床症状、白细胞含量变化、组织病理变化等指标,构建动物发病模型。从86份疑似猫瘟粪便样品中成功分离到6株猫细小病毒,其中GX01株TCID_(50)及血凝价均高于其他5株;不同剂量GX01感染猫后均表现出高热、腹泻、呕吐和体重下降等典型临床症状;感染后第3天粪便中检测到病毒;发病后期白细胞严重减少;攻毒第14天测定LD_(50)为1×10~(-2).2;解剖表现为肠臌气、部分脏器肿大有出血点;组织病理切片观察到十二指肠和肺上皮细胞出现胞浆、胞核侵染、坏死等明显的组织病变,肾出现脂肪变性。本研究成功分离6株广西地区猫细小病毒并建立发病动物模型,为猫细小病毒发病机制和治疗药物的研究奠定了基础。     

致狐狸眼炎大肠杆菌的生物学特性检测与致病性分析

为确定辽宁省某狐狸养殖场致患病狐狸眼炎的病原菌,从患病狐狸眼部分离病原菌,并对分离株进行形态观察、生化试验、16S rRNA基因序列测定、血清分型及进化分群,在此基础上完成了毒力基因检测、药敏试验以及人工感染小鼠试验等。镜检结果显示,该细菌为革兰阴性短杆菌,最终鉴定结果可以确定此分离株为O25型大肠杆菌,并且2株菌均属于系统发育群B2群。毒力基因检测结果显示,其含有CNF-Ⅰ基因,无LT、K99、STa、SLT-Ⅰ、CNF-Ⅱ及EAE等毒力基因。人工感染小鼠试验显示,2株分离菌株均可引起小鼠眼睛发炎,化脓等疾病,其对小鼠的半数致死量(LD50)分别为3.60×10~6CFU/只、1.79×10~6 CFU/只。药敏试验表明,其对庆大霉素、环丙沙星、黏菌素及氯霉素耐药性较强,但对头孢噻肟、磺胺甲恶唑、四环素、左氧氟沙星、氟苯尼考及大观霉素等抗生素较为敏感。本研究结果为临床治疗由大肠杆菌引起的狐狸眼炎提供了重要依据。     

血清4型猪链球菌的分离鉴定及其致病性和药物敏感性分析

为了确定扬州市某猪场发病猪的病原,本研究从送检的病死猪肺组织中分离了1株细菌。经16S r DNA测序和gdh基因PCR扩增,证实分离的细菌为猪链球菌。用猪链球菌分型引物进行PCR扩增鉴定分离菌株的血清型,结果显示,该菌株为猪链球菌4型。生长曲线分析显示,在添加10%新生牛血清的TSB培养基中,分离菌株比猪链球菌2型SC19菌株生长迅速。小鼠感染试验结果显示,分离菌株具有高致病性。药敏试验结果显示,分离菌株对青霉素类和头孢类药物敏感。本研究为猪链球菌4型的防控提供了理论依据,也为后续猪链球菌4型的致病机制研究奠定了基础。     

马链球菌兽疫亚种纤连蛋白结合蛋白的原核表达及其免疫原性的检测

根据已发表的纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FNZ)基因(fnz)序列,设计并合成1对引物,以马链球菌兽疫亚种(SEZ)ATCC35246菌株基因组DNA为模板,PCR扩增fnz基因,并定向将其克隆至表达载体pET-32a(+)中。重组质粒pET-32a(+)-fnz经酶切及测序鉴定后,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,表达产物经Western-blot检测后进行纯化,得到了74ku的纯化蛋白。以纯化的FNZ与ISA206佐剂以1∶1的体积比混合后免疫ICR小鼠,每只小鼠背部皮下多点注射120μL(含蛋白22.5μg),14d后以同样方法进行加强免疫。间接ELISA检测结果表明,FNZ免疫组小鼠的血清FNZ抗体效价显著高于其他3个对照组。二免后第15天小鼠腹腔注射ATCC35246菌液5.0×105 CFU(10LD50),观察注射后10d内小鼠的临床表现及存活状况;结果显示,FNZ免疫组小鼠的存活率为62.5%,显著高于阴性对照组(0)和空白对照组(0),但低于SEZ灭活疫苗免疫组(87.5%)。结果表明,FNZ可使免疫小鼠对SEZ的感染产生一定的抵抗作用。     

一株猪源脑心肌炎病毒的分离与鉴定

将江苏省某规模化猪场疑似脑心肌炎仔猪病料接种BHK-21细胞,并采用间接免疫荧光试验(IFA)、基因序列测定和动物人工感染试验进行鉴定,结果显示,BHK-21细胞接种病料样品后盲传3代出现细胞病变,病毒TCID50为10-9.2/mL;用脑心肌炎病毒(EMCV)单克隆抗体-IFA检测,在感染细胞的胞浆中可见特异性荧光;分离物的PCR扩增产物的基因序列与GenBank中的EMCV VP1基因的同源性为85.7%~99.8%;BALB/c小鼠人工感染该分离株后出现明显的临床症状和EMCV的典型病理变化,免疫组织化学试验证明,试验鼠脑组织中含有EMCV抗原,商品仔猪人工感染后未出现明显的临床症状及病理变化,证明该分离病毒为EMCV(NJ08株),且对BALB/c小鼠具有较强的致病作用。     

应用BALB/c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB/c小鼠,同时设空白对照组,每组8只。免疫后每7 d采血一次,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清抗体水平;第28 d用800LD50同源强毒攻击,攻毒后36 h,每组随机选取3只BALB/c小鼠,采全血,分别用每只BALB/c小鼠全血注射12只乳鼠,每组共注射36只乳鼠,以乳鼠试验判定BALB/c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明,免疫组BALB/c小鼠均可产生特异性抗体,保护率分别为75.0%、63.9%、36.1%;对照组小鼠血清抗体为阴性。提示,BALB/c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

鹅艾美球虫致病性的研究

按每只鹅3×104和0.5×104个孢子化卵囊的剂量感染18日龄天山白鹅,以临床症状、肉眼病变、病理组织学变化、平均增重、病变记分和死亡率为观察指标,对鹅艾美球虫(Eimeria an-seris)的致病性进行了研究。结果显示,不同剂量感染引起的临床症状和各病死鹅的肉眼病变基本相似。各感染组的平均增重与对照组均差异显著(P<0.05)。各感染组平均病变记分与未感染对照组差异极显著(P<0.01);感染相同剂量组之间的平均病变记分差异不显著(P>0.05),感染不同剂量组之间的平均病变记分差异显著(P<0.05)。不同感染剂量组均发生死亡,死亡率分别为10%~30%和60%~90%。结果表明,E.anseris具有极强的致病性。     

中华按蚊源日本脑炎病毒的分离鉴定及其分子特征的分析

为了解上海市蚊源日本脑炎病毒(JEV)的分子特征,2014年从上海市嘉定区猪场采集蚊媒样品1万余份,采用BHK21和C6/36细胞培养法进行病毒分离,通过RT-PCR和IFA技术对分离株进行鉴定。结果表明,分离到1株JEV,命名为JD-15,源自中华按蚊。用JD-15株分别感染BHK21和C6/36细胞,72 h后所有细胞均发生明显病变(CPE),其细胞半数感染量(TCID50)为1.96×106PFU。用分离株JD-15脑内接种3周龄乳鼠,结果测得半数致死量(LD50)为4.2×101PFU,表明该毒株具有较强的神经毒力。对JD-15株的E基因进行克隆测序及进化分析,结果显示,该株JEV属于基因Ⅲ型,与减毒活疫苗株SA-14-14-2的E基因核苷酸序列的同源性为98.1%,氨基酸序列的同源性为97.5%。本研究为乙型脑炎的流行病学调查提供了科学依据,对上海市蚊虫及蚊媒病的防治具有重要意义。     

山羊源志贺菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究

对采集自四川部分地区的226份羔羊粪便样本进行志贺菌的分离鉴定,同时对分离菌株进行血清型鉴定,并用PCR检测其携带sat、sen、set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A、ipa H共10个毒力基因的情况;采用灌胃法检测携带毒力基因最多的4株优势血清型菌株培养物对BALB/c小鼠的致病力。经细菌分离鉴定,从226份样本中共分离到54株志贺菌;血清型鉴定结果显示,4株的血清型为福氏志贺菌1a型,11株的血清型为福氏志贺菌1b型,28株的血清型为福氏志贺菌2b型,11株的血清型为福氏志贺菌3b型。54株志贺菌均携带sat、sen、ipa H基因,而set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A基因的阳性携带率分别为73.6%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%,每个菌株携带4~10种毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b型优势血清型菌株均在1.7×108CFU/m L剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠的LD50为1.04×106CFU;致死小鼠的组织病理学检查显示,心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,提示结肠为该菌入侵的最有可能部位。本研究阐明了山羊源志贺菌的部分生物学特性,为山羊志贺菌病的防控提供了科学依据。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H重组亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫保护效果,将纯化的牦牛源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白H(rOmpH)制备成疫苗,用该重组疫苗和全菌灭活疫苗皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA方法检测其抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离株进行攻毒,比较两者的保护力。结果显示,全菌灭活疫苗组小鼠30h后死亡率为20%,重组疫苗组小鼠30h后100%死亡,PBS对照组小鼠24h后100%死亡。结果表明,全菌灭活疫苗具有保护力,而重组蛋白疫苗保护性微弱。     

猪伪狂犬病病毒变异株R13028株生物学特性及致病性的研究

为了解天津地区猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的流行情况,2013年从疑似PRV病例中分离纯化获得一株野毒株(R13028株),对其g C基因进行测序及分析,并研究病毒的细胞增殖特性和致病性。结果显示,R13028株与参考毒株相比在139位至189位缺失51 bp核苷酸,遗传进化分析显示该毒株与中国分离株的同源性高于欧美毒株,属于基因Ⅱ型,它与LA株的核苷酸同源性最高为99.7%。R13028株可在PK-15、BHK-21、Marc-145、Vero和ST细胞增殖,TCID50测定结果表明ST细胞和PK细胞更适于R13028株的增殖。将PRV R13028株和经典强毒株SC株接种7周龄BALB/c小鼠后LD50分别为1×104.5TCID50和1×104.0TCID50。将两个毒株以1×106TCID50剂量经滴鼻途径分别接种6周龄和9周龄猪,发现SC株(5/6头死亡)对猪的致死性高于R13028株(2/6头死亡)。但R13028株感染后猪体温升高和神经症状更为明显,试验猪发病和死亡时间早于SC株。本研究为猪伪狂犬病病毒的致病机制及防控研究提供了一定的理论依据。     

青蒿浸膏对昆明小鼠和Wistar大鼠的急性毒性试验

青蒿浸膏为青蒿素提取过程中的初提物,它可以提高动物生长性能和机体免疫力,有抗鸡球虫、杀灭纤毛虫等功效,在畜牧养殖上有广泛的应用前景,然而其毒性大小尚未见报道。本试验采用Bliss法设计,分别对昆明小鼠和Wistar大鼠单次灌胃青蒿浸膏(青蒿素的质量分数为170 g/kg±10 g/kg),测定它对昆明小鼠和Wistar大鼠的半数致死量(LD50)及其95%可信限,分别观察7 d内昆明小鼠和Wistar大鼠的毒性反应和死亡情况,对昆明小鼠和Wistar大鼠分别进行大体解剖和组织病理学检查。结果,各剂量组小鼠均未出现明显的中毒症状,自由活动正常,饮食饮水正常,且无死亡个体;各剂量组雌、雄小鼠的体重也没有显著变化。与小鼠不同,大鼠毒性症状随青蒿浸膏的剂量增加而逐渐加重,4120 mg/kg剂量组仅见自发活动减少;6 460mg/kg和8 080 mg/kg组可见少量个体震颤、强制性-阵挛性抽搐,死亡等症状;10 100 mg/kg剂量组小鼠可见震颤、强制性-阵挛性抽搐、角弓反张、死亡等症状。Wistar大鼠的LD50为7 360 mg/kg,95%的可信限为6 256.38~8 658.82 mg/kg。上述试验结果表明,青蒿浸膏属于无毒物质。