口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。     

羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。     

山羊源志贺菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究

对采集自四川部分地区的226份羔羊粪便样本进行志贺菌的分离鉴定,同时对分离菌株进行血清型鉴定,并用PCR检测其携带sat、sen、set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A、ipa H共10个毒力基因的情况;采用灌胃法检测携带毒力基因最多的4株优势血清型菌株培养物对BALB/c小鼠的致病力。经细菌分离鉴定,从226份样本中共分离到54株志贺菌;血清型鉴定结果显示,4株的血清型为福氏志贺菌1a型,11株的血清型为福氏志贺菌1b型,28株的血清型为福氏志贺菌2b型,11株的血清型为福氏志贺菌3b型。54株志贺菌均携带sat、sen、ipa H基因,而set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A基因的阳性携带率分别为73.6%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%,每个菌株携带4~10种毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b型优势血清型菌株均在1.7×108CFU/m L剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠的LD50为1.04×106CFU;致死小鼠的组织病理学检查显示,心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,提示结肠为该菌入侵的最有可能部位。本研究阐明了山羊源志贺菌的部分生物学特性,为山羊志贺菌病的防控提供了科学依据。