犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

传染性腔上囊病病毒HN01超强毒株VP2基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的传染性腔上囊病病毒(IBDV)标准强毒株52-70株基因组序列,设计并合成了1对扩增IBDV VP2基因的特异性引物.以IBDV超强毒分离株HN01感染发病鸡腔上囊组织中提取的病毒RNA为模板,用RT-PCR扩增出了1.45 kb的cDNA产物,将扩增的IBDV HN01株VP2基因克隆于pMD 18-T载体上,获得了pMD 18-T-VP2重组质粒.将IBDV HN01株 VP2基因序列测定结果与已发表的其他IBDV毒株VP2基因序列进行分析比较,绘出系统进化树.结果表明,HN01株与欧洲超强毒株UK661、日本超强毒株OKYM、香港超强毒株HK46等非常相似,而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大.     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

猫细小病毒广西分离株FPV-GX01全基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西地区猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的生物学特性,阐明其基因组与遗传进化等特征。笔者采集经胶体金检测FPV阳性的粪便样品接种FK81细胞,进行病毒分离及理化特性鉴定,同时利用PCR分段扩增病毒基因组DNA,并与国内外分离株进行同源性及遗传进化比较分析。结果显示,分离株在FK81细胞上盲传3代后出现CPE,猪红细胞血凝价达1∶1 024,第5代病毒TCID50测定为10-5.2/0.1 m L,该毒株对热、酸、氯仿及乙醚有较强的抵抗力,将分离株命名为FPV-GX01。全基因测序结果表明,分离株基因组为4 901 bp,与2007年我国猫源细小病毒株FPV-XJ1同源性高达99.0%,属同一分支。氨基酸位点分析显示,FPV-GX01株VP2蛋白功能较少发生突变,与犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)氨基酸位点存在宿主差异;FPV-GX01 NS1蛋白序列上没有VP2蛋白稳定,第619位异亮氨酸突变成苯丙氨酸。广西地区分离的猫细小病毒也在不断发生遗传变异进化,本研究对该地区猫细小病毒的进化特征提供了一定的参考。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

水貂肠炎病毒疫苗株和野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立

为了建立水貂肠炎病毒(MEV)疫苗株与野毒株的鉴别检测方法,根据GenBank中的水貂肠炎病毒序列设计了1对引物,用来扩增包含水貂肠炎病毒NS1基因在内的2 013bp大小的片段。通过对国内疫苗毒MEVB株及其他细小病毒参考株的NS1基因序列比较发现,疫苗毒MEVB株NS1基因核苷酸1401位的碱基由T变为C,致使1399位～1404位的核苷酸构成由ATTGAT变异为ATCGAT,多了1个限制性内切酶ClaⅠ酶切位点,其他MEV分离毒株中均未出现此酶切位点。用特异性引物扩增出2 013bp的目的片段后,再用限制性内切酶ClaⅠ进行酶切分析,疫苗毒MEVB株被切割成1 404bp和609bp的2个片段,国内其他分离株均未出现上述片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗毒MEVB株和野毒株。     

四株鸽Ⅰ型副黏病毒的分离鉴定及基因型分析

为掌握安徽省鸽Ⅰ型副黏病毒病的流行特点及其与鸡新城疫各分离株的相互关系,对从安徽省不同鸽场鸽病料中分离的4株病毒(AH-2012、AH-2012-1、AH-2012-2、AH-2012-3),采用RT-PCR、血清学试验及基因序列测定等方法进行鉴定。结果显示,这些分离株均具有血凝性,并能使NDV标准阳性血清特异性抑制;PCR扩增出F基因特异性目的片段,其核苷酸序列与GenBank上登录的鸽Ⅰ型副黏病毒的同源性较高,相似性达94.8%;与传统的鸡源新城疫病毒标准株LaSota、F48E9的同源性较低,相似性约为80%;F基因编码蛋白的第112～117位氨基酸序列为R-R-Q-K-R-F。结果表明,这些毒株为鸽Ⅰ型副黏病毒,属于基因Ⅵ型。     

14株基因C型鸭甲肝病毒分离株的VP1基因变异及其编码蛋白的抗原表位分析

对14株分离自四川不同地区的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1基因进行了PCR扩增、测序、序列比对分析以及抗原表位分析。结果显示,14株DHAV-C VP1基因核苷酸序列的同源性为92.2%～100%,推导氨基酸序列的同源性为85.8%～100%,与GenBank中的24株DHAV-C VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.9%～99.3%和80.8%～100%。聚类分析显示,四川华阳地区分离的6株DHAV-C的VP1基因与黑龙江分离株Du/CH/LJS/090905同属一支,3株四川邛崃地区分离株与北京分离株C-GY及福建分离株FJ01同属一支,4株四川郫县分离株与1株四川邛崃分离株处于独立的小分支,它们与其他毒株之间存在一定的遗传距离。DHAV-C VP1蛋白由240个氨基酸组成,是由α螺旋、β折叠和无规则卷曲共同组成的混合型蛋白,VP1蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面可及性均较高,其中212～222位氨基酸区域的亲水性、抗原指数和表面可及性最高,可能是DHAV-C VP1蛋白上的B细胞表位优势区域,为DHAV-C表位疫苗的研究提供了理论依据。结果表明,四川分离株可能由于引种等原因从全国不同地区进入四川境内。     

用RAPD技术分析鸡毒霉形体广西分离株的DNA多态性的研究

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,以随机引物成对组合的方式对鸡毒霉形体(MG) 5株广西分离株和 3株标准株DNA进行了多态性分析。结果显示 ,所选用的 2 0条引物中 ,有 3对 (6条 )引物扩增的条带为 2～ 10条 ,大小在 2 0 0～ 30 0 0bp。相似指数分析显示 ,广西MG分离株Y2与WL、CH与Y3的相似指数最高 ,分别为 0 .92和 0 .86 ,其与H2的相似指数为 0 .36～ 0 .6 2。 3株MG标准毒株S6、K2 2 2 1、K15 0 1与广西分离株间的相似指数为 0 .17～ 0 .5 7。表明广西流行的MG与MG标准株存在差异 ,当地的流行株也呈现多样性     

猪流感病毒广东株的分离鉴定及其特性

对广东省 2 5个猪场有呼吸道症状的 30～ 6 0日龄仔猪 ,用棉拭子采样 ,接种鸡胚分离病毒。经鉴定 ,7株为H1N1亚型毒株。对其中 3株分离株的形态学、部分理化特性和生物学特性的研究结果表明 ,病毒粒子在透射电镜下为杆状、丝状、椭圆形及圆形 ,大小为 80～ 12 0nm ;血凝素(HA)均为热不稳定型 ;均不耐热且对乙醚、氯仿敏感 ;均能凝集公鸡、豚鼠、兔、大白鼠、山羊等动物红细胞 ,对小白鼠红细胞的凝集性有所不同 ,均不凝集牛和猪红细胞 ;经绒毛尿囊腔接种 9日龄鸡胚 ,不能导致鸡胚死亡 ,EID50 分别为 10 — 6 .17/ 0 .2mL、10 - 5.83/ 0 .2mL、10 - 4.4 3/ 0 .2mL ;经鼻腔途径感染小白鼠 ,均未导致小鼠出现症状和死亡 ,接种后第 14d在部分存活的小鼠血清中可检出病毒抗体。     

2007-2011年广东省猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解广东省2007-2011年猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异情况,采用PCR方法对本实验室分离到的49株PCV2分离株进行全基因组克隆和序列分析。所分离的毒株全长分别为2株1 766bp、45株1 767bp、2株1 768bp。通过序列比对进行遗传变异分析,无论是这49株病毒间还是与GenBank中的8株PCV2基因组间的核苷酸同源性均为93.2%～99.9%;在遗传演化关系上,49株分离株分布于2个大群,分别为PCV2b和PCV2d分支。提示目前疫苗毒株不处于广东地区PCV2流行毒株分支中,应该引起高度的重视。     

鹅细小病毒VP1基因的克隆及序列分析

参照GenBank中收录的鹅细小病毒 (GPV)B株基因序列设计并合成了扩增GPVH1株VP1的 1对引物 ,利用PCR技术扩增出长约 2 .2kb的目的片段 ,将其克隆到 pMD 18 T载体上 ,进行了序列测定及分析。测序结果表明 ,GPVH1株VP1基因由 2 199个核苷酸组成 ,编码 732个氨基酸。经与B株、YG株进行同源性比较 ,核苷酸的同源性分别为 98.5 0 %和 93.18% ;推导的氨基酸同源性分别为 98.0 9%和 95 .77%。     

绵羊与藏羊脑静脉系统整体铸型制作方法的建立

为了获得完整的脑部静脉血管通路塑料模型,经过反复试验,首次建立了脑静脉血管系统的整体铸型方法。选择新鲜的藏羊和绵羊头各15个,将用丙酮和丁酮稀释的200g/L ABS(丙烯腈、丁二烯、苯乙烯三元共聚塑料)溶液经上颌静脉灌入脑静脉窦及脑静脉血管内,经2～3d后,等待ABS溶液完全凝固时,用盐酸腐蚀掉脑、脑膜以及构成颅腔的颅骨,然后对血管铸型进行冲洗和修整。获得了完整的脑部静脉血管系统立体铸型。该铸型标本能够清楚地显示脑静脉窦和血管的位置、走向、管径及其相互之间的关系,同时还能够清晰地显示出颅内外静脉血管之间的联系。该方法的建立使整体展现脑内静脉血管系统成为现实,也为进一步深入研究脑静脉系统奠定了基础。     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内容物为材料,用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养,分离到50株乳酸菌,经生化鉴定为嗜热链球菌(2株)、乳酸乳球菌(1株)、保加利亚乳杆菌(5株)、嗜粪乳杆菌(10株)、嗜酸乳杆菌(8株)、乳酸乳杆菌(9株)、肠乳杆菌(10株)、弯曲乳杆菌(5株)。采用乳酸菌16 S rDNA通用引物,对分离的8种菌的16 S rDNA一段可变区序列进行扩增,均得到大小约470 bp的产物;扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较,同源性均大于97．5％,同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实,牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富,且乳杆菌的数量较多,这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

应用RAPD技术分析禽多杀性巴氏杆菌广西分离株的DNA多态性

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,以随机引物单条或成对组合的方式对 9株禽巴氏杆菌 (PM )广西分离株和 3个参考株的DNA进行了多态性分析。结果显示 ,在选用的 2 0个引物中 ,有 4对引物 (4条引物成对组合 )扩增的条带为 1～ 16条 ,其长度在 90～ 2 6 0 0bp。相似指数分析显示 ,PM广西分离株GX2与GX4的相似指数最高 ,为 0 .97;GX7与B2 6T12 0 0的相似指数最低 ,为 0 .2 1,C4 8 1标准强毒株与PM广西分离株间的相似指数为 0 .33～ 0 .6 4。表明广西当地的流行株呈现多样性 ,与PM标准强毒株存在差异。     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。