马立克病病毒单克隆抗体的制备

以纯化的经鸡胚成纤维细胞(CEF)培养的马立克病病毒(MDV)超强毒株GX0101病毒粒子作为免疫原,制备特异性识别MDV的单克隆抗体。GX0101感染CEF后第96小时收集细胞并反复冻融3次,离心取上清,选用100 ku的切向流超滤离心管浓缩,浓缩液通过Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶作为层析介质分离纯化MDV病毒粒子,聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR分析不同收集峰MDV病毒含量,并经过透射电子显微镜观察到直径约100 nm的MDV病毒粒子。进一步用100 ku的切向流超滤离心管浓缩,制备峰尖病毒浓缩液,以此免疫雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和Western-blot筛选,最终获得107个阳性克隆,由其中1株强阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株10B2制备的单克隆抗体腹水IPMA效价为1∶2.56×10~6。本研究结果为后续MDV单克隆抗体的筛选、鉴定及诊断试剂研发奠定了重要基础。     

马立克病抗性选育对鸡感染马立克病病毒后外周血淋巴细胞病毒载量的影响

为研究马立克病(MD)抗性选育对鸡马立克病病毒(MDV1)感染后外周血淋巴细胞病毒载量的影响,利用MDV1攻毒后第4、7、10、14、21、28和35天共7次采集并分离的全部试验鸡的外周血淋巴细胞为材料,采用real-time FQ-PCR方法对这些材料中meq基因进行绝对定量分析以确定其病毒载量,用来分析比较MDV1在MD抗性鸡与普通鸡以及HVT疫苗免疫鸡与HVT疫苗未免疫鸡体内的增殖情况。结果显示,普通鸡非免疫攻毒组(B组)的MDV1含量于攻毒后第10(P0.05)、14(P0.05)、21(P0.01)、28(P0.05)、35(P0.05)天显著高于MD抗性鸡免疫攻毒组(F组),而其他组间均无显著性差异。结果表明,鸡MD抗性选育结合HVT疫苗接种可显著降低鸡体内的病毒载量,从而降低MDV1感染的危害。     

应用酶联免疫吸附试验检测马传贫血清抗体

我们应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和琼脂扩散沉淀试验(ID)对马传贫非疫区健康马,人工和自然感染马,免疫马的血清进行了对比检查,结果报告如下。 (一)材料 1.抗原:由哈尔滨兽医研究所提供的马传贫弱毒细胞培养物纯化冻干抗原,每瓶1.5mg。 2.酶结合物:由哈尔滨兽医研究所提供的辣根过氧化物酶标记的羊抗马Ig冻干物,每瓶15μg。     

马立克病毒感染鸡端粒酶活性的研究

对1日龄非免疫鸡分别接种马立克病病毒(MDV)Ⅰ型国际标准强毒GA株、国内标准强毒京1株及Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株后第5d起,用改进的TRAP法和Bandscan软件测定分析、计算感染过程中鸡外周血淋巴细胞(PBMC)的端粒酶活性。结果,自接种MDVⅠ型强毒GA株和京1株后,在鸡尚未出现临床症状和可视病变之前端粒酶就可被检测到,并且随着感染鸡日龄的增加逐渐升高,分别在20～25日龄时其相对活力达到最高值;接种MDVCVI988后,整个试验期端粒酶活性均呈阴性。试验结果表明,MDVCVI988疫苗株具有较可靠的免疫效果,PBMC端粒酶活性与马立克病的发病进程具有一定的相关性。     

牦牛腹泻病原—轮状病毒的调查

国内外研究资料表明,轮状病毒是引起小儿腹泻的主要病原,也是引起家畜腹泻的重要病原之一,特别是对新生犊牛和猪的感染更为重要,本实验为了解四川省阿坝自治州牦牛腹泻病原,于1985年5月在该地区采集腹泻牦牛的粪便标本,应用酶联免疫吸附试验(HLISA)、酶联免疫吸附试验阻断试验(ELISA阻断)、免疫电镜(IEM)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行检测轮状病毒的感染情况。     

检测马立克氏病血清型特异性单克隆抗体的酶联免疫吸附试验

马立克氏病(MD)是由疱疹病毒科马立克氏病毒(MDV)引起鸡内脏淋巴瘤和外周神经淋巴增生为特征的传染性疾病。根据免疫荧光抗体(IFA)试验;免疫扩散(ID)试验和血清中和(SN)试验等血清学方法,Bullow和Biggs将MDV分为三个不同血清型:血清1型病毒,包括致病性毒抹和它们的减毒弱毒株、血清2型病毒是非致病性MDV毒抹;血清3型病毒,包括所有的火鸡疱疹病毒     

斑点酶联免疫吸附试验简介

斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)是以微孔滤膜为固相载体的一项新的免疫酶技术,其敏感性和特异性与放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)相类似,并可弥补RIA和ELISA不可避免的一些缺陷。该法于1982年由荷兰学者Herbrink首先建立。嗣后,很快被许多国家学者吸收应用与继续研究,并发表了不少论文。迄今,对于本技术的命名尚未统一,不同学者的叫法不尽一致。Herbrink等称为抗原斑点试验(Antigen spot Test),Howker等称为免疫结合斑点试验(Dgt-immunobinding Assay),Huet等称为斑点免疫测定(Spotimmuno Detection),而Pappas等则称为斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)。笔者认为Pappas的叫法最合适,故本文称该法为Dot-ELISA。     

马立克病鸡可作为研究人类动脉粥样硬化的一种动物模型

1967年Churchill和Biggs报道了马立克氏病的病原因子是一种疱疹病毒,但早在1950年Paterson等已发现,感染马立克氏病病毒(MDV)的鸡群中动脉粥样硬化的发病率比未感染的对照组高些。由于人类已广泛地被五种人的疱疹病毒所感染,所以把MDV感染的小鸡作为研究人类动脉粥样硬化的动物模型是很有意义的。现将1977～1985年间Fabricant和Minick等的试验简要介绍如下。 (一)诱发动脉粥样硬化的试验 4组小公鸡都是美国康乃尔大学饲养的白来航P系SPF鸡,用100PFU低毒力的MDV CU-2株感染两组小鸡,隔离饲养;另两组不感染MDV,作为对照。0～15周龄这4组小鸡都饲喂含胆固醇0.025％(W/W)的饲料(以下简称普通饲料)。从第16周开始,一组感染小鸡和     

用Dot-ELISA快速检测绵羊种布氏菌病

将斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)用于检测绵羊布氏菌(Brovis)感染并和常规ELISA、R-SAT、R-Coombs进行比较。结果在150份血清标本中Dot-ELISA的检出率为65.3％;ELISA 64.0％;R-SAT 38.6％;R-Coombs52.7％。并用50份S型布氏菌阳性血清和8份TB阳性血清进行了Dot-ELISA试验,结果全部阴性,未发生交叉反应。3次重复试验结果一致。结果证明本方法敏感性高,特异性强,操作简便快速,易于基层推广使用。     

基于禽偏肺病毒N蛋白的间接ELISA检测方法的建立和初步应用

为进一步了解我国鸡群禽偏肺病毒(aMPV)的感染情况,加强对aMPV的防控,应用RT-PCR方法扩增出aMPV N基因的保守片段并连入原核表达载体pET32a-1中,再转入Rosseta(DE3)细胞进行表达,表达的蛋白经纯化后作为包被抗原,经一系列条件优化,建立间接ELISA检测方法并进行初步应用。结果显示,成功表达且纯化了重组N蛋白,以此N蛋白建立的间接ELISA方法对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、白血病病毒(ALV)、马立克病病毒(MDV)等血清的检测结果为阴性;而阳性血清1∶3 200稀释时仍检测为阳性结果;批内和批间重复性试验的最大变异系数均小于10%。应用建立的间接ELISA方法与商品化aMPV ELISA试剂盒对样品进行平行检测,阳性符合率为95.88%(256/267),阴性符合率为93.22%(55/59),总符合率为95.40%(311/326)。应用本方法对广西地区7个种鸡场和6个肉鸡场的960份血清进行检测,结果,种鸡血清aMPV抗体阳性率为93.33%(784/840),肉鸡血清aMPV抗体阳性率为99.17%(119/120)。本研究建立的间接ELISA方法为该病的早期诊断与流行病学调查提供了技术手段。     

应用酶联免疫吸附试验诊断弓形虫病

1984～1986年,本课题协作组在广西、北京、福建、安徽、黑龙江、浙江等省市的6个单位进行了弓形虫病酶联免疫吸附试验诊断方法的研究,建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)。 葡萄球菌A蛋白—酶联免疫吸附试验(SPA—ELISA)固相免疫酶底物珠试验(DASS),玻片虫体过氧化物酶联免疫吸附试验(TSHE),玻片虫体—葡萄球菌A蛋白酶联吸附试验(TSSH)5种酶联试验方法,现汇总报告如下。     

酶标记双抗原夹心法检测黄牛的腹腔指状丝虫抗体

国外丝虫病的酶标记检测方法从1975年Bartlett等用于盘尾丝虫和各种动物丝虫的检测。国内1985年有用ELISA法检测人工感染羊脑脊髓丝虫病(牛腹腔丝虫感染期幼虫对羊的侵袭病)的抗体的报道。本试验主要用辣根过氧化物酶(HRP)标记牛腹腔指状丝虫的大分子抗原,用双抗原夹心法检测牛腹腔指状丝虫的自然感染黄牛血清抗体。结果达到80％的阳性检出率,明显高于免疫双扩散试验的检出率。 (一)丝虫和血清来源     

茯苓多糖对雏鸡细胞免疫活性的影响及其抗肿瘤作用

给 1日龄AA雏鸡经腹腔注射马立克氏病病毒 (MDV)强毒株 ( 0 .2mL/只 ) ,并从当日开始给试验组雏鸡以 3个剂量连续肌肉注射茯苓多糖 1周 ,分别于 7、14、2 8、4 2、5 6日龄取脾组织 ,制备脾细胞悬液 ,用ELISA法检测了雏鸡淋巴细胞转化率、NK细胞活性及M活性 ,并与对照组比较。结果表明 ,3个剂量均可显著提高雏鸡的淋巴细胞转化率、NK细胞活性及M活性 ,且中剂量组效果优于其他 2个剂量组。证实茯苓多糖能提高MDV强毒株感染雏鸡的细胞免疫活性 ,并具有抗肿瘤作用     

鸡马立克病毒野毒株在鸭胚成纤维细胞上的培育及鉴定

用2006～2007年从现地采集的疑似感染鸡马立克病(MD)鸡羽髓分别接种鸭胚成纤维细胞(DEF),蚀斑克隆纯化后,随机选1个单克隆,再接种DEF增殖,获得9株适应DEF的鸡马立克病病毒(MDV)野毒株,分别命名为ZY、FY、SY、YC、CZ、MS、CGZ、QQHE和DH.应用PCR技术分别扩增这9株MDV的132 bp重复序列(132 bpr),发现这9株132 bpr均为2个拷贝,符合致病型MDV的特点.从分离的9株MDV中选择5株,人工感染7日龄SPF白来航鸡.试验鸡表现精神萎靡,被毛凌乱,个体瘦小;60d后剖杀,大多可见内脏肿瘤;SY、FY、QQHE 3株的MD临床阳性率达100%.     

应用酶联免疫吸附试验检测羊衣原体性流产抗体的研究

免疫酶技术是一项新兴的免疫化学测定技术。而ELISA(酶联免疫吸附试验)用于人和畜禽的衣原体抗体的检测,只是近几年来才开展研究。自Lewis(1977年)报道了用ELISA法检测衣原体抗体以来。Evans(1982年)和Nancy J.(1983年)又分别报道了用ELISA检测人血清中衣原体抗体的试验,之后Evans(1983年)又发表了用ELISA法检测鸭血清中衣原体抗体的试验报告。他们通过ELISA与CF(补体结合反应)和MIF微量荧光试验)比较,认为ELISA是一种简单、方便、敏感的试验方法。用ELISA法检测羊衣原体抗体,在国内还未见报道。为此,我们进行了ELISA法检测羊衣原体抗体的试验。其结果:免疫及强毒感染山羊95％表现ELISA阳性;健康对照山羊均表现为阴性反应;从送检的流产山羊血清样品中,有61％查出了衣原体抗体。     

基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

本研究旨在毕赤酵母中表达鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的VP3蛋白,以重组VP3蛋白作为包被抗原建立IBDV血清抗体免疫磁珠间接ELISA检测方法并进行初步应用。利用毕赤酵母表达系统获得约为39 ku的重组VP3蛋白,Western-blotting检测表明,重组VP3蛋白具有良好的特异性和反应原性。免疫磁珠间接ELISA的最佳反应条件:磁珠和抗原偶联的缓冲液是50 mmol/L MES(p H 8.0),偶联时间为3 h,抗原加入量为95μg,抗原与羧基磁珠最大偶联量为80μg。待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶1 600和1∶4 000,血清孵育时间为30 min,酶标二抗孵育时间为20 min。在该优化条件下,阴性、阳性临界值判定标准为0.134。特异性试验显示,对抗AIV、IBV、MDV、NDV阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验显示,本试验所建立的检测方法敏感性高于商品化IBDV血清抗体检测试剂盒。重复性试验显示,批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.8%和5.9%。稳定性试验结果显示变异系数小于7%。用建立的检测方法和商品化IBDV血清抗体检测试剂盒同时检测50份血清,结果显示两种检测方法的相对敏感性为94.6%,相对特异性为92.3%,符合率为94.0%。本试验建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、稳定性高特点,为其应用于临床IBDV血清抗体的检测奠定了基础。     

应用DotELISA检测鸡白血病病毒群特异性抗原

利用斑点酶联免疫吸附试验( DotELISA) 的基本原理,根据蛋清可以直接吸附在硝酸纤维素( NC) 膜上的特点,建立了DotELISA 检测鸡白血病病毒(ALV) 群特异性抗原的方法,并与双抗体夹心酶联免疫吸附试验( DASELISA) 进行比较,两种方法具有相同的特异性和敏感性。     

马立克病病毒1型LZ1309株的分离鉴定与生物特性分析

从免疫马立克病(MD)HVT和CVI988疫苗的甘肃某规模化鸡场采集MD阳性病鸡抗凝全血,分离淋巴细胞,接种于鸡胚成纤维细胞,分离出1株马立克病病毒(MDV)。病毒蚀斑纯化后经PCR和间接免疫荧光鉴定,该毒株为MDV1型毒株,命名为LZ1309株。PCR扩增并测序致瘤基因meq。核苷酸同源性分析结果显示,与国内分离株LS株的同源性最高(99.9%),与CVI988株的同源性最低(98.8%)。氨基酸序列分析显示,氨基酸突变位点符合国内强毒株的特征。为掌握LZ1309株的致病力,进行了LZ1309株攻毒试验。结果显示,LZ1309株攻毒组鸡的死亡率为13.3%,攻毒组鸡体重显著降低,肝、脾、腺胃乳头和心脏均出现肿瘤结节,胸腺和法氏囊严重萎缩。PCR检测攻毒鸡的器官组织,均能扩增到MDV1型强毒株meq基因的特异性条带。本研究成功分离鉴定出1株MDV强毒株,此结果为研究国内MDV毒力演化、致病机理和疫苗研发奠定了重要基础。     

用3AB-ELISA鉴别猪口蹄疫病毒感染与疫苗免疫猪的研究

采用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB(FMDV 3AB)多肽为抗原,A G蛋白 辣根过氧化物酶为酶结合物,过氧化氢 四甲基联苯胺为底物溶液,建立了一种可鉴别FMD感染与灭活疫苗免疫猪血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(I ELISA),即3AB ELISA。通过对1779份健康猪、免疫猪及人工感染猪血清的检测,确定了该I ELISA的阳性 阴性判定临界值。该检测方法比VIAA AGID法检出率高,尤其是采用A G蛋白酶结合物后操作更简便。     

广西玉林地区MDV强毒YL2002株的分离鉴定

广西玉林地区鸡马立克氏病(MD)疫苗免疫鸡群出现MD疫情,笔者从出现MD疫情的规模化肉鸡养殖场采集抗凝血,分离得到MDV野毒株,鉴定为血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV),命名为YL2002。与15株参考毒株进行比对,meq基因核苷酸同源性分析结果显示,YL2002株与JS201801株MDV同源性最高,为100%;与648A株同源性最低,为98.6%。将分离得到的MDV野毒株回归动物实验,分析其对肉鸡品种黄鸡2号的致病性,该分离株攻毒组发病鸡出现瘫痪症状,并发现心脏、肝肿瘤。病理组织学观察可见各组织出现淋巴细胞增生和浸润。致病性结果显示,YL2002攻毒组发病率和死亡率为100%和69.2%。本试验成功分离得到1株MDV强毒株,为广西玉林地区频发的马立克氏病疫情的防控提供了理论基础,也为我国MDV的毒力演化研究提供了参考。