乳鼠成骨细胞的培养及鉴定

无菌采取5日龄SD大鼠的颅盖骨,用胰蛋白酶预消化后,漂洗,剪碎,再用Ⅱ型胶原酶消化获得成骨细胞。通过倒置相差显微镜观察,并用碱性磷酸酶和矿化结节染色鉴定,利用微量滴定(MTT)法测定一个培养周期的成骨细胞活性分布,探讨一种经济、高效的原代成骨细胞培养方法。倒置相差显微镜形态观察结果显示,未贴壁的细胞呈圆形,贴壁生长的细胞呈不规则梭形、三角形或多角形,单核,有1~3个核仁;碱性磷酸酶和钙化结节染色均呈阳性(阳性率≥98.06%);MTT法结合形态学观察结果显示,成骨细胞培养至第10 d时活性最强。证实用改良的二次酶消化法能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。     

大鼠神经干细胞的分离培养和分化

分离大鼠大脑皮质及皮质下组织 ,经消化及机械吹打后 ,用悬浮培养法、有限稀释法获得来源于同一细胞的亚细胞系克隆 ;用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞 (NSCs)。结果 ,从大鼠大脑皮质及皮质下分离的组织 ,经原代和传代培养均可形成细胞克隆 ,并具有增殖能力 ;原代和传代细胞抗原与抗巢蛋白 (nestin)单克隆抗体反应呈阳性 ;单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结果表明 ,用此方法分离的细胞具有自我更新和分化潜能 ,有很强的增殖能力 ,是属于中枢神经系统的干细胞。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

硝酸镧对MDCC-MSB1细胞形态及细胞周期的影响

以体外培养的MDCC-MSB1细胞为研究对象,分剐经终浓度为0、8、32、64ìg/mL的硝酸镧作用24、48、72 h后,采用台盼蓝染色测定细胞活性,荧光显微镜观察细胞的形态学变化,流式细胞术测定细胞周期.研究了硝酸镧对鸡MD肿瘤细胞株MDCC-MSB1细胞形态及细胞周期的影响,进而探讨硝酸镧对MDCC-MSB1细胞的影响机制.结果表明,硝酸镧能够降低MDCC-MSB1的细胞活性,能够引起典型的凋亡形态学变化及细胞周期的改变,并呈现细胞凋亡的细胞型,变化均呈现时间-剂量效应.证实,一定浓度的硝酸镧具有诱导体外培养MDCC-MSB1细胞凋亡的作用.     

辛硫磷对大鼠肝细胞凋亡的影响

通过给大鼠肝细胞培养液中加入辛硫磷(染毒终浓度分别为3、10、30、100和300 μmol/L)染毒,于12、24 h后用流式细胞仪分别测定细胞凋亡率、细胞死亡率和细胞内活性氧(ROS)水平,并在扫描电镜和荧光显微镜下观察细胞凋亡情况,研究了辛硫磷对原代培养大鼠肝细胞凋亡的影响.结果显示,辛硫磷具有明显的细胞毒性,在3～100 μmol/L范围内随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长,细胞死亡率、凋亡率和ROS水平显著升高,且发生了明显的细胞凋亡的形态学变化;但300 μmol/L辛硫磷培养24 h,肝细胞凋亡率和ROS水平下降,死亡率升高.表明辛硫磷对肝细胞有直接的毒性作用,并通过产生ROS诱导了肝细胞凋亡.     

伪狂犬病病毒感染对ST细胞生长及ATP酶活性的影响

以伪狂犬病病毒(PRV)容A株体外感染ST细胞为模型,观察PRV对ST细胞生长状态以及胞内Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和总ATP酶活性的影响。根据ST细胞对PRV的敏感剂量,接种ST细胞后第2、12、24、36和48小时观察细胞的生长状态,MTT法检测细胞的增殖能力,用试剂盒检测细胞的ATP酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和总ATP酶)活性。结果,与对照组相比,在感染后第24小时之前试验组ST细胞的生长状态较好;24h后,细胞活性降低,逐渐发生细胞凋亡。Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和总ATP酶活性在PRV感染过程中变化趋势相似,PRV感染后第24小时之前,Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性和总ATP酶活性略高于对照组;第36小时,细胞ATP酶总体活性水平明显低于对照组(P<0.05);第48小时两组之间ATP酶活性差异极显著(P<0.01),其中Ca2+-Mg2+-ATP酶活性较为敏感。     

线粒体复合物与氧化应激在锰致鸡胚神经细胞凋亡中的作用

为探讨线粒体复合物及氧化应激在锰致体外培养鸡胚脑神经细胞凋亡中的作用,以体外培养的鸡胚脑神经元为研究对象,在含终浓度为0、1.5、2.0、2.5mmol/LMnCl2的DMEM培养液中培养24h,检测神经元内ROS和GSH含量、线粒体呼吸链复合物活性、细胞凋亡指数。结果显示,随着MnCl2浓度的增加,线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均呈降低趋势,线粒体呼吸链复合物Ⅴ先升高后降低,细胞内ROS含量增加,GSH含量呈降低趋势,鸡胚脑神经元细胞凋亡指数增加,出现凋亡的形态学变化。表明MnCl2能抑制线粒体复合物活性,引起氧化应激,诱导鸡胚脑神经元发生凋亡。     

镉对大鼠大脑皮质神经细胞线粒体氧化损伤及能量代谢的影响

为了研究镉对大鼠大脑皮质神经细胞线粒体氧化损伤及能量代谢的影响,以原代大鼠大脑皮质神经细胞为模型,用不同浓度的醋酸镉(0、5、10、20μmol/L)处理原代大鼠大脑皮质神经细胞24h后,流式细胞仪测定活性氧(ROS)水平,试剂盒测定线粒体中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性和丙二醛(MDA)含量,Western-blot法检测SDHA蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,10或20μmol/L醋酸镉组中ROS水平、MDA含量极显著升高(P0.01),SOD、CAT、GSH-Px、SDH活性极显著下降(P0.01),SDHA蛋白表达水平明显降低(P0.05或P0.01)。结果表明,镉能引起大鼠大脑皮质神经细胞线粒体氧化损伤及能量代谢障碍,并且与镉的浓度呈明显的剂量-效应关系。     

pIRES2-EGFP-LR真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

为探讨层黏蛋白受体的生理功能及其在疾病发生、发展过程中的作用,以培养的SD大鼠大脑皮质神经元的总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增了SD大鼠层黏蛋白受体基因.将其克隆到pMD18-T载体中,经酶切纯化后再将其亚克隆到带有加强型绿色荧光蛋白报告基因的pIRES2-EGFP真核表达栽体中,对重组质粒pIRES2-EGFP-LR进行酶切和测序鉴定后,采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到293T细胞,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其表达情况.结果表明,真核表达载体plRES2-EGFP-LR构建成功并可以在293T细胞中表达.该表达载体可以作为研究层黏蛋白受体生理功能的重要工具.