利用CRISPR/Cas9技术敲除TLR3基因及其影响NDV复制的研究

TLR3是Toll样受体家族成员之一,在天然免疫与适应性免疫应答中均发挥重要作用。为探究TLR3在NDV感染中的作用机制,本研究针对犬TLR3基因设计了2个sgRNA,构建重组质粒,转染MDCK细胞,经PCR、测序、Western-blot检测敲除情况,CCK-8方法检测细胞增殖速度;新城疫病毒La Sota毒株感染细胞,荧光定量PCR分析病毒增殖水平和TLR3、TLR7、MDA5、IFN-β和IFIT1的m RNA水平。结果,筛选出1株TLR3基因缺失7 bp的MDCK细胞。Western-blot结果显示,TLR3蛋白不表达,其增殖速度与野生型MDCK细胞无显著差异。新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-WT细胞后,TLR3的m RNA含量在四个时间点均显著上调(P0.01),表明新城疫病毒La Sota毒株可激活TLR3。再以新城疫病毒La Sota毒株感染MDCK-TLR3-/-细胞,IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第12小时和第24小时显著降低(P0.01),病毒拷贝数在感染后第6、12和24小时显著高于WT组(P0.01),表明TLR3在NDV介导的IFN-β反应和IFIT1的表达中具有重要作用,能够抑制NDV的复制。TLR7和MDA5的m RNA含量在感染后第6小时和第12小时显著上调(P0.01),IFN-β和IFIT1的m RNA含量在感染后第48小时表达显著上调(P0.01),NDV的拷贝数在第48小时在两组间显著性差异消失,提示TLR3缺失后TLR7和MDA5对其具有代偿作用。上述研究结果对NDV介导的天然免疫应答及疾病防控等研究具有重要意义。     

新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的表达及其表达产物的免疫原性

应用RT-PCR获得新城疫病毒(NDV)La Sota株的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因片段,将HN基因片段定向插入毕赤酵母表达载体pPICZaA,构建了分泌型表达载体pPICZaA-HN,将其用Sac I线性化后电转化入P.pastoris X-33.经高抗性及阳性转化子筛选得到重组菌株X-33/pPICZaA-HN,甲醇诱导后,表达产物的上清液经SDS-PAGE、Western-blot和血凝活性检测,结果约在97 ku处有目的条带.比预期分子质量大,占总蛋白的53%,与NDV阳性血清发生特异性免疫反应,并具有较高的血凝活性.表明,HN基因在毕赤酵母中成功地进行了表达且表达产物具有良好的免疫原性.     

表达EGFP蛋白新型重组新城疫病毒疫苗载体的构建

为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达外源蛋白,在p NDFLSP-m F的P基因与M基因之间引入PmeⅠ酶切位点,并将EGFP基因编码区克隆至构建好的p NDFLSP-m F载体中,构建含有EGFP基因的重组质粒p NDFLSP-m F-EGFP。将p NDFLSP-m F-EGFP以及辅助质粒p CI-NP-K、p CI-P-K、p CI-LK共转染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,拯救获得了重组病毒La Sota-m FEGFP。通过RT-PCR证明,被拯救的重组病毒中含有插入的外源基因EGFP。荧光观察和Western-blot分析结果表明,EGFP蛋白能在重组病毒中稳定表达。生物学特性测定结果显示,La Sota-m F-EGFP具有低毒力毒株特征,MDT为144 h,能够在鸡胚上有效地复制,EID50为1×108.75/0.1 m L。上述研究结果为研制和开发新型NDV载体疫苗奠定了基础。     

重组鹅源新城疫病毒HN基因乳酸菌的构建

构建了重组鹅源新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸杆菌后,将HN基因亚克隆至可在乳酸杆菌和大肠杆菌中穿梭表达的载体pSIP409中。此后,将构建的阳性重组体pSIP409-HN采用电转化方法转化至植物乳酸杆菌感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western-blot检测HN蛋白的表达情况。为明确HN蛋白的表达位置,利用流式细胞术检测了重组菌细胞是否有HN蛋白的表达。结果显示,克隆了NDV HN基因,构建了阳性重组质粒pSIP409-HN;鉴定结果表明,阳性重组质粒pSIP409-HN被成功电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,构建的重组菌可以表达与HN蛋白已知大小相符的条带(66ku),且该蛋白能与NDV阳性抗体反应,具有反应原性。流式细胞术检测结果表明,HN蛋白被表达于菌体细胞表面,可作为黏膜疫苗的候选抗原。     

利用酵母随机展示文库筛选与鉴定基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白B细胞抗原表位

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)给全世界家禽养殖业造成了严重的经济损失。HN蛋白是NDV上的重要囊膜蛋白,能诱导鸡体内的免疫系统产生保护性抗体。为了鉴定HN蛋白上的B细胞表位,本研究成功构建了基因Ⅶ型NDV HN蛋白的酵母随机展示文库,该文库的库容量为5×105 CFU,插入的片段随机分布。利用NDV高免血清标记HN蛋白的酵母随机展示文库,然后通过流式细胞分选技术分选阳性克隆细胞进行测序分析。结果显示,阳性文库中150号多肽(GAPVHDPDYIGGIGKE)含量很高。对150号多肽进行截短分析,结果表明该多肽中VHDPDYIGGI序列为最小的B细胞表位,该表位能与感染NDV的高免血清普遍反应。因此,VHDPDYIGGI多肽是基因Ⅶ型NDV HN蛋白中广泛存在的B细胞表位。本研究结果为将来开发新城疫新型ELISA检测试剂盒以及表位疫苗奠定了基础。     

GFP标记的重组新城疫病毒HN基因乳酸菌表达载体的构建及原核表达

为构建具有示踪特性的新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸菌穿梭表达载体,采用PCR方法扩增NDV HN基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因,将两基因克隆至乳酸菌表达载体pW425et中,转化入表达宿主菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导表达。用荧光显微镜检查重组菌的绿色荧光效应,采用SDS-PAGE和Western-blotting检测其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,NDV HN和GFP基因与表达载体pW425et正确重组。荧光显微镜下可见阳性重组菌落的绿色荧光,且该重组菌传代30代次以上,荧光效应依然稳定。SDS-PAGE显示表达出约63ku的条带,与已知表达的HN蛋白大小相符。Western-blotting进一步证实该蛋白能被NDV阳性血清所识别,具有反应原性。构建了GFP标记的重组NDV HN基因乳酸菌穿梭表达载体且能在大肠杆菌中表达。     

表达EGFP标签的重组血清4型禽腺病毒的构建及评价

我国当前流行的禽腺病毒血清4型(FAdV-4)毒株与国外毒株相比存在自然缺失。为了解我国流行的FAdV-4毒株的复制能力和特点以及病毒毒力的增强机制,本研究以我国当前流行的基因组3′端自然缺失株HN/151025为亲本病毒,采用同源重组技术,在HN/151025毒株基因组35430～35431自然缺失位点插入EGFP表达盒,构建带有EGFP标签的重组病毒rHN-△35430-EGFP。获得的重组病毒在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,重组病毒在LMH细胞连续传代5代,EGFP基因随病毒的传代而稳定遗传,且EGFP蛋白稳定表达。病毒生长曲线测定结果显示,带有EGFP标签的重组病毒与亲本病毒的生长动力学趋势基本一致,均在接种后第96小时病毒滴度达到高峰,但是重组病毒滴度与亲本病毒差异显著(P0.05)。对重组病毒感染细胞能力进行评价,结果表明,表达荧光信号的细胞比例从感染后第24小时逐渐增多,至感染后第96小时达到高峰,该结果与病毒生长曲线结果一致。本研究结果表明,FAdV-4病毒基因组3′端可作为标签基因插入位点,为进一步研究病毒复制和感染机制奠定基础。     

新城疫病毒F48E9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

免疫鸽群中2株新城疫病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了研究目前免疫鸽群中新城疫病毒(NDV)感染发病的原因,对2011年从江苏省和湖南省2个免疫过的发病鸽场分离到的2株鸽源NDV进行了生物学特性的测定以及遗传进化分析,并将其与疫苗株La Sota进行交叉中和试验。结果显示,NT-10株为强毒株,HuN株为中等毒力。对其F基因的遗传进化分析表明,二者均为Ⅵb亚型NDV,均为强毒裂解位点,F蛋白上有3个区别于其他基因型的特征性氨基酸位点,即132S,259H,380N。中和试验结果表明,2个NDV分离株与La Sota的抗原性差异很大。结果表明,Ⅵb亚型仍然是鸽群中新城疫病毒的主要流行株,该亚型具有明显的宿主感染特异性;鸽源Ⅵb亚型NDV分离株与La Sota的抗原性差异较大,这可能是免疫鸽群中发生NDV感染的重要原因之一,有必要研制用于预防鸽群中Ⅵb亚型NDV感染的新型疫苗。     

新城疫病毒调控宿主YB-1蛋白的初步研究

为了揭示YB-1蛋白在新城疫病毒(NDV)感染中的作用,对NDV感染细胞中YB-1表达水平以及亚细胞定位的变化进行了初步探索。利用RT-PCR技术,从鸡胚成纤维细胞中扩增了鸡源YB-1蛋白基因,序列分析结果显示其与其他物种YB-1有较高的相似性,与人YB-1的核苷酸和氨基酸相似性分别为88.3%和78.9%。随后利用间接免疫荧光技术检测了感染NDV强毒株Herts/33的He La和DF-1细胞中内源性YB-1蛋白的亚细胞定位变化,用q RT-PCR方法检测了YB-1 m RNA表达水平,通过Western-blot检测了YB-1蛋白水平的时相变化。结果显示,He La细胞中YB-1主要存在于细胞质,而禽源DF-1细胞YB-1集中在细胞核内;感染NDV后,两种细胞中的YB-1蛋白均在细胞质内呈现颗粒化聚集,同时在NDV感染后期He La细胞中YB-1蛋白出现少量降解。该研究初步揭示了NDV感染过程中YB-1蛋白的迁移现象,推测与NDV的复制过程相关,其具体的作用机制以及对NDV复制的影响尚待更深入的研究。     

基因Ⅶ型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-optiF。通过SWISS-MODEL网站对蛋白结构进行预测,结果显示,质粒pCAG-optiF编码的蛋白能够形成与人呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象相似的结构。将质粒pCAG-optiF转染至鸡源细胞LMH中,通过间接免疫荧光试验证实构建的蛋白在鸡源细胞中成功表达。将质粒p CAG-optiF转染悬浮培养的Expi293F细胞,表达并纯化获得重组蛋白roptiF。SDS-PAGE电泳结果显示获得了与预期大小相符的蛋白。Western-blotting结果显示,表达的roptiF蛋白能够与NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的抗血清反应。进一步通过负染色电子显微镜观察roptiF蛋白结构,结果显示,roptiF蛋白具有典型的F蛋白融合前构象的结构特征。本研究成功获得了具有融合前构象的基因Ⅶ型NDV F蛋白,并且该蛋白能够与抗NDV的血清反应,本研究结果为研制新型NDV疫苗奠定了基础。     

蓝舌病毒VP6蛋白的原核表达及抗体制备

本试验首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病毒1型(BTV1)的VP6基因,然后将其克隆到表达载体pPRoEx-HTb上,构建重组表达质粒pPro-VP6,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后用IPTG诱导表达,优化表达条件,纯化重组表达的VP6蛋白,免疫新西兰白兔制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot和细胞免疫荧光试验检测抗体的特异性及VP6蛋白在BTV1感染细胞中的分布。结果显示,重组VP6蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的VP6蛋白;制备的抗VP6多克隆抗体不仅可与重组表达的VP6蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然VP6蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞中检测到了VP6蛋白的特异表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组VP6蛋白并制备了相应的特异抗体,为进一步揭示VP6蛋白的特性和功能奠定了基础。     

基因Ⅶ型新城疫病毒HN蛋白茎区居间序列突变株的拯救及其生物学特性的分析

为了探究新城疫病毒(NDV)HN蛋白茎区居间序列氨基酸突变对其蛋白及病毒生物学特性的影响,利用overlapping PCR分别扩增包含E91A和S92A突变的HN基因,并将突变引入真核表达质粒pCAGGS及NDV全长cDNA中。通过红细胞吸附试验、神经氨酸酶试验等分析突变对蛋白功能的影响;并通过反向遗传操作技术拯救突变病毒,分析突变对病毒生物学特性的影响。结果显示,E91A突变能显著增强HN蛋白的红细胞吸附活性,同时显著降低神经氨酸酶活性;而S92A突变则导致蛋白的红细胞吸附活性及促融合功能显著下降;并且2个突变均会显著削弱病毒的复制能力,在一定程度上降低病毒毒力,影响其组织嗜性。研究结果表明,HN茎区居间序列的E91和S92氨基酸突变对蛋白及病毒的生物学特性具有重要影响,可作为减毒疫苗株改造及小分子药物设计的靶标位点。     

山羊源副流感病毒3型JS2013株HN基因的原核表达与抗原性分析

参考GenBank中牛副流感病毒3型(BPIV3)内蒙古09株(NM09)全基因组序列(GenBank登录号:JQ063064),设计了1对特异性引物以扩增山羊源副流感病毒3型(PIV3)JS2013株HN基因部分序列;将扩增到的基因测序后进行同源性分析。同源性分析结果表明,它与已报道的HPIV3、BPIV3 HN基因的序列同源性最高,分别为74.3%、79.8%。进化树分析表明,JS2013株并不属于HPIV3与BPIV3,形成一个独立的分支。将HN基因片段克隆至原核表达载体pET-32a(+),获得原核重组质粒pET-32a(+)-HN。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌株中,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE与Western-blot试验分析表明,重组蛋白诱导表达成功,并以包涵体形式存在,大小为46ku。经Western-blot试验验证,重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备的超免疫血清能够与重组蛋白反应;把病毒接种给MDBK细胞后,间接免疫荧光试验表明重组蛋白的多克隆抗体与病毒产生特异性荧光反应,表明该重组蛋白具有很好的免疫原性和反应原性。本试验结果为山羊源副流感病毒3型感染诊断方法的建立和疫苗的研制奠定了基础。     

新城疫病毒HN基因与T4噬菌体SOC基因在大肠埃希氏菌中的融合表达

用RT PCR方法扩增了新城疫病毒 (NDV)的完整HN基因序列 ;设计了 1对带有EcoRⅠ限制位点的引物 ,用PCR扩增出了HN基因片段。将该片段克隆至 pSOC质粒SOC基因 3′端 ,成功构建了重组质粒pSOC HN。用该重组质粒转化E .coliBL 2 1(DE3)感受态细胞 ,以终浓度 1mmol/mL的IPTG诱导表达。在SDS PAGE凝胶上可检测到分子质量约 6 7ku的特异条带 ,蛋白质印迹法证实 ,表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性     

CVN重组蛋白体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的研究

本研究以Gen Bank中蓝藻抗病毒蛋白N(CVN)基因序列(DQ668406.1)为基础,合成CVN基因,构建表达质粒pMAL-c5x-CVN,通过优化诱导条件,表达出可溶性CVN重组蛋白。利用cck8试剂盒检测CVN重组蛋白对Marc-145细胞的毒性,并在安全浓度范围内进行了抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)试验。在PRRSV感染Marc-145细胞的吸附、穿入和复制三个阶段进行检测,探究CVN体外抗PRRSV的作用效果。各阶段的病毒TCID_(50)检测、间接免疫荧光试验以及qPCR测定结果表明,CVN在PRRSV感染宿主细胞过程中的入侵阶段发挥阻断作用,而在病毒吸附细胞和在细胞内复制的阶段没有抑制效果。本研究为新型抗PRRSV药物的研发奠定了试验基础。     

DF-1细胞中泛素-蛋白酶体系统对新城疫病毒复制的影响

为研究DF-1细胞的泛素-蛋白酶体系统(UPS)是否参与新城疫病毒(NDV)在细胞中复制的过程。使用Western-blot检测感染NDV Herts/33毒株的细胞样品以判断细胞内泛素化蛋白水平的变化,并检测NDV感染对细胞26S蛋白酶体水解活性的影响。检测泛素-蛋白酶体系统抑制剂对NDV感染后细胞上清中病毒滴度的影响,以及抑制剂MG-132对NDV在细胞中生长状况的影响。结果显示,虽然感染NDV后DF-1细胞内泛素化蛋白水平并未发生明显变化,但26S蛋白酶体的活性显著升高;使用泛素-蛋白酶体系统抑制剂可以抑制NDV在DF-1细胞中的复制。本研究结果证明DF-1细胞内泛素-蛋白酶体系统参与了NDV在DF-1细胞中的复制过程。     

新城疫病毒通过巨胞饮作用入侵HeLa细胞的研究

新城疫病毒(NDV)在体外可以感染多种细胞,但是感染机制尚未完全明确。本试验针对NDV通过巨胞饮途径感染He La细胞的过程进行研究,选择特异性针对巨胞饮作用的药物抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(EIPA)、肌动蛋白(actin)聚合作用抑制剂细胞松弛素D(Cyto D)、PK C激酶抑制剂卡马拉素(Rottlerin)等,分别作用于He La细胞,通过W estern-blot和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测NDV感染He La细胞的情况。结果显示,在病毒感染后第3、6小时,EIPA能显著抑制NDV的进入,并且存在药物剂量的依赖性,同时,Cyto D和Rottlerin在第3、6和12小时也能显著抑制NDV的进入。结果表明,巨胞饮作用可能是NDV侵入细胞的一种重要途径,该结果将有助于进一步解析NDV的感染方式。     

新城疫病毒La Sota及F48E9毒株P和V及W蛋白C端功能域的原核表达及其多克隆抗体的制备

以新城疫病毒La Sota、F48E9株为模板,扩增获得P、V、W基因C末端。原核表达后利用Ni柱纯化6种融合蛋白,并制备6种多克隆抗体,ELISA效价测定结果均大于1∶2 560,Western-blot试验结果表明其具有良好的特异性。本研究成功地制备了La Sota、F48E9株P、V、W蛋白的多克隆抗体,为进一步研究新城疫病毒P、V、W蛋白的生物学功能奠定了基础。     

PRRSV标记病毒样颗粒的制备及其鉴定

当今预防猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的灭活苗和弱毒苗都存在不可避免的局限性,所以研制新型疫苗势在必行。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)在形态结构上与天然病毒粒子无异,生物安全指数高,是理想的传统疫苗替代品。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)粒子主要由能够诱导产生中和抗体的GP5蛋白和具有强细胞免疫力的M蛋白组成基本框架结构。本研究以2型高致病性PRRSV的GP5蛋白和M蛋白为研究对象,通过Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建标记型PRRSV VLPs,同时探索核衣壳蛋白N对VLPs形成的影响。在本试验中将含有Myc标签的GP5(Myc-GP5)和含有His标签的M(His-M)蛋白基因分别克隆至pFastBac dual载体的p10和pH双元启动子下;N蛋白基因克隆至pFastBac HTB载体上,转染sf9和Highfive细胞后,GP5、M和N蛋白均被成功表达。透射电镜观察结果表明,Myc-GP5和His-M能够自动组装成VLPs,并且与天然PRRSV形态一致,具有双层膜结构,直径大小在40~60 nm。采用抗M蛋白的家兔血清进行免疫电镜观察,结果显示,Myc和His双标记型VLPs与天然病毒一样都能够被金颗粒标记,而且共感染的N蛋白不影响标记型VLPs的组装。本研究首次采用昆虫杆状病毒表达系统成功制备了PRRSV的双标记型VLPs,具备与天然病毒相似的特性,为开发高效安全以及能够区分感染与免疫VLPs疫苗奠定了基础。