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当今预防猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的灭活苗和弱毒苗都存在不可避免的局限性,所以研制新型疫苗势在必行。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)在形态结构上与天然病毒粒子无异,生物安全指数高,是理想的传统疫苗替代品。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)粒子主要由能够诱导产生中和抗体的GP5蛋白和具有强细胞免疫力的M蛋白组成基本框架结构。本研究以2型高致病性PRRSV的GP5蛋白和M蛋白为研究对象,通过Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统,构建标记型PRRSV VLPs,同时探索核衣壳蛋白N对VLPs形成的影响。在本试验中将含有Myc标签的GP5(Myc-GP5)和含有His标签的M(His-M)蛋白基因分别克隆至pFastBac dual载体的p10和pH双元启动子下;N蛋白基因克隆至pFastBac HTB载体上,转染sf9和Highfive细胞后,GP5、M和N蛋白均被成功表达。透射电镜观察结果表明,Myc-GP5和His-M能够自动组装成VLPs,并且与天然PRRSV形态一致,具有双层膜结构,直径大小在40~60 nm。采用抗M蛋白的家兔血清进行免疫电镜观察,结果显示,Myc和His双标记型VLPs与天然病毒一样都能够被金颗粒标记,而且共感染的N蛋白不影响标记型VLPs的组装。本研究首次采用昆虫杆状病毒表达系统成功制备了PRRSV的双标记型VLPs,具备与天然病毒相似的特性,为开发高效安全以及能够区分感染与免疫VLPs疫苗奠定了基础。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的核衣壳蛋白N是一种含量高、免疫原性强、最早刺激机体产生特异性抗体的主要结构蛋白,研制针对N蛋白抗体的检测方法对进一步实现PRRS的流行病学监测和诊断具有重要意义。本研究以带有MBP标签的p MAL-C4X作为表达载体,实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,每升菌液经纯化可得约20 mg的融合N蛋白。Western-blot结果表明,融合N蛋白能被抗MBP的单抗和PRRSV N蛋白的家兔多抗特异识别。以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法不与猪圆环病毒2型(PCV2)、古典猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的阳性猪血清发生交叉反应,但与1型PRRSV阳性猪血清有较强反应性。田间样品检测结果表明,本研究建立的间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90%左右。本研究以MBP作为促溶标签,实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达,重组蛋白具有良好的免疫反应性,这为深入研究N蛋白功能以及开发PRRS相关诊断制剂奠定了基础。 相似文献
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干扰素(IFN)作为机体抗病毒感染的第一道防线,已广泛应用于许多疾病的治疗中。作为Ⅰ型干扰素家族的一员,干扰素limitin于2000年被发现,然而目前国内外对该干扰素的研究尚停留在初级阶段。为了进一步研究limitin干扰素的生物学特性及其潜在的应用价值,本试验将密码子优化过的小鼠limitin基因克隆至载体pET-30a(+)中,IPTG诱导表达limitin重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用Westernblot进行验证。检测结果显示,表达的limitin重组蛋白的大小为23.86 ku,主要以包涵体形式存在,经纯化后获得高纯度的蛋白,并能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别,最后利用生物信息学技术对这种干扰素蛋白进行了生物学预测与分析。结果表明,本研究成功表达并纯化出小鼠limitin重组蛋白。 相似文献
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