犬细小病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

参照GenBank中犬细小病毒(CPV)VP2基因保守区域序列设计合成特殊的内、外引物,在扩增反应体系中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,通过恒温荧光检测仪Deaou-308C扩增检测,建立了一种快速检测CPV的实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法。结果显示,这种方法对CPV具有特异性的扩增反应,对照病毒核酸的扩增结果均为阴性。灵敏度试验最低可检出3.72 copies/μL的病毒核酸。重复性试验结果表明,其检测重复性良好。对30份临床宠物犬的粪便样品进行检测,与免疫胶体金检测试纸方法进行比较,符合率为90%。将本方法初步应用于大熊猫粪便中犬细小病毒的检测,结果表明,从大熊猫基地采集的84份粪便样品中有16份为细小病毒阳性,阳性率为19.0%。本方法在63℃下恒温45 min可以完成检测,操作简单、灵敏度高、特异性强,通过恒温实时荧光检测仪可实时检测及自动判读检测结果,对大熊猫的早期诊断非常重要。     

猪萨佩罗病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的检测方法,根据GenBank中PSV的5′端非编码区基因的保守序列设计并合成1对针对PSV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PSV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PSV与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪嵴病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒区分开,特异性强。检测下限为6.37×102 copies/μL,比普通PCR敏感100倍,敏感性高。扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RTPCR的批内变异系数为0.44%~1.14%,批间变异系数为0.70%~1.32%,重复性较好。应用该方法对采集自四川省部分地区的58份有腹泻症状的猪粪便进行检测,实时荧光定量RT-PCR检测阳性率为56.9%,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的实时荧光定量RT-PCR特异性较强、灵敏度高,可用于该病毒的临床检测、定量分析及流行病学调查。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r20.999),平均试验间变异系数为0.26%;检测敏感性可达到2×101 copies/μL。应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97%。结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测。     

猪腺病毒3型SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对猪腺病毒3型(PADV3)的检测方法,根据PADV3E1B基因保守序列设计1对引物,建立了检测PADV3的SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR。结果显示,该方法不能对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、猪链球菌2型检测到荧光信号,特异性好;检测PADV3时在3.7×102~3.7×109 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,熔解温度为90.5℃;该方法组内变异系数为0.17%~1.23%,组间变异系数为0.73%~2.23%,重复性较好。应用该方法对临床56份腹泻粪便检测,检出11份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。上述结果表明,建立的实时荧光定量PCR为PADV3感染的早期诊断、流行病学调查奠定了技术基础。     

溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确检测猪溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,优化反应条件,建立了检测溶血性曼氏杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒pMD-MH-16S为标准品建立的标准曲线在3.06×10~8~3.06×10~1copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到3.06×101 copies/L的标准品阳性质粒。该方法与其他24种常见细菌均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和普通PCR方法对65份临床样品进行检测,阳性率分别为56.92%和21.54%,阳性符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

内蒙古绵羊梅迪-维斯纳病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种检测内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒(MVV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据高度保守的gag基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了快速检测MVV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示,扩增相关系数为0.999,对重组标准质粒的最低检测量为1.0×10~0 copies/μL,对羊的其他肺炎表现常见病原核酸无扩增反应;利用该方法对内蒙古地区12份疑似病例的肺组织进行检测,其中3份为MVV阳性。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法在MVV的快速、准确诊断中具有良好的应用前景,也将为内蒙古地区防控梅迪-维斯纳病提供可靠的检测手段。     

牛诺如病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻的病原,为建立高效快速、特异的BNoV定量检测方法,本研究参照GenBank登录的BNoV的RdRp基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应条件和体系,建立了BNoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法选择的引物具有高度特异性,只对BNoV有特异性扩增,而对牛冠状病毒等4种犊牛腹泻常见病原未见扩增;对BNoV核酸最低检测限为15.9 copies/μL,且批内、批间变异系数均小于2%,重复性好。对采集自2017年9月至2019年11月河南、山东和四川省的261份犊牛腹泻样本进行检测,结果显示BNoV的阳性检出率为11.49%(30/261)。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法对BNoV的病原检测和流行病学调查具有重要意义。     

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp),选择Mccp arc D基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立并优化反应体系,以Mccp和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板,进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测,并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示,仅Mccp有扩增条带(185 bp)和明显的荧光扩增信号(Ct值为21.93),其余供试菌株没有扩增条带,且表现出微弱的荧光扩增信号(Ct值均大于31)。普通PCR检测的灵敏度为5.96×104copies/L,而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5.96 copies/L。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1%。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测,结果有2份为Mccp阳性样本,阳性率为2.94%。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。     

猪环曲病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪环曲病毒(porcine torovirus,PToV)N基因的保守序列,设计合成1对针对PToV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PToV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PToV与猪伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、沙门菌和大肠杆菌区分开来,特异性强。检测PToV的N基因在8.65×101~8.65×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.998 9,扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.29%~1.30%,组间变异系数为0.45%~1.80%,重复性较好。利用该方法对采集自四川部分地区的43份临床样品进行检测,实时荧光定量RTPCR检出13份阳性样品,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性较强、灵敏度高,可用于该病的临床检测和流行病学调查。     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

兔出血症病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。     

猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。     

犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测犬圆环病毒(CanineCV)和犬细小病毒(CPV)的方法,根据CanineCV和CPV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增CanineCV和CPV的片段大小分别为984和668 bp。并将反应条件进行优化,建立了CanineCV和CPV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增CanineCV和CPV的目的条带,且未扩增出其他犬胃肠道病原;CanineCV和CPV的最低检出限分别为85.7和312 copies/L。对采集自广西地区的223份临床样品的检测结果显示,CanineCV的阳性率为2.24%(5/223)、CPV的阳性率为5.38%(12/223),后者与常规PCR检测方法相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于CanineCV和CPV的检测和流行病学调查。     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种快速鉴别检测致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA和白细胞毒素(lktA)基因保守序列设计特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了鉴别致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法与其他24种常见牛羊细菌均无交叉反应,具有较好的特异性;其检测lktA基因阳性和阴性溶血性曼氏杆菌的最低检出限度均为40 copies,具有较好的敏感性。应用建立的双重荧光定量PCR方法和普通PCR方法对48份临床样品进行检测,这2种方法检出的溶血性曼氏杆菌阳性率分别为27.1%和18.8%,检出lktA基因阳性溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为20.8%和12.5%,阳性符合率为100%。本研究中建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊溶血性曼氏杆菌致病性与非致病性菌株感染的高通量快速鉴别诊断提供了可行手段。     

羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列设计合成了1对引物,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测ORFV核酸的SYBRGreenⅠreal-timePCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.999;检测灵敏度可达9.4×104copies/μL;与绵羊痘病毒(SPV)不发生交叉反应,具有良好的特异性;组内Ct值相同,组间变异系数小于2%。应用建立的方法检测20份疑似羊传染性脓疱病病料,结果17份为阳性,同时用常规PCR进行检测,结果仅10份为阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可初步用于ORFV的检测。     

牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为鉴别牛结节性皮肤病病毒野毒株(wild type lumpy skin disease virus,WT LSDV),本研究根据GenBank中发表的WT LSDV全基因组序列,设计并合成1对特异性引物和MGB探针,优化反应条件,建立了鉴别检测WT LSDV的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该方法仅对WT LSDV核酸有特异性扩增,对LSDV疫苗株等其他病毒核酸无交叉反应;标准曲线在一定浓度范围内呈现良好的线性关系,标准曲线为y=-3.361 x+34.979,R~20.999,扩增效率为98.39%,最低检测限为4.6 copies/μL。组内、组间重复性试验的变异系数均小于3%。对63份模拟临床样品的检测结果显示,本研究建立荧光定量PCR方法的阳性检出率为90.57%,OIE推荐的普通PCR方法的阳性检出率为64.15%,两种方法检测临床样品均为WT LSDV核酸阴性。结果表明,建立的WT LSDV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速、重复性好,且能快速准确地检测WT LSDV,适用于临床样品的鉴别检测,为该病的鉴别、监测、防控提供了技术支撑。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速鉴别检测塞内卡病毒A(SVA)和脑心肌炎病毒(EMCV)的方法,根据SVA和EMCV高度保守的3D基因区域,分别设计了2对特异性引物和带2种不同发光基团标记的TaqMan探针,建立同时检测这2种病毒核酸的双重TaqMan荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果显示,该检测方法对SVA和EMCV的最低检测量分别为760 copies/μL和98 copies/μL,并且能够特异性检测出SVA和EMCV,而对猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等检测结果均为阴性。本方法中所建立的标准曲线呈现良好的线性关系,重复性试验组内和组间变异系数均低于5%,说明该检测方法重复性高。本研究所建立的双重荧光定量PCR具有方便、快速、特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,能够用于SVA和EMCV的同时检测。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。