猪巨细胞病毒gB基因优势抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

扩增了猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因的优势抗原表位区,将构建成功的gB基因优势抗原表位区原核表达重组质粒(pET32a-gB)转化入表达菌Rosetta(DE3)中进行表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA检测方法进行了优化。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.9μg/mL,最佳血清稀释度为1∶160,二抗最佳稀释度为1∶10 000;当样品D450nm≥0.26时判为阳性,当样品D450nm<0.215时判为阴性,介于两者之间时判为可疑。用该间接ELISA方法对138份PCMV阴性血清与240份PCMV阳性血清进行检测的结果显示,它的特异性为97.83%,敏感性为97.9%,变异系数均小于10%。用该ELISA方法和Western-blot对184份临床样品进行检测,结果二者的符合率为92.4%。结果表明,该间接ELISA方法简便快捷,具有良好的特异性、敏感性及重复性,适用于对PCMV抗体的大规模检测。     

猪环曲病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪环曲病毒(porcine torovirus,PToV)N基因的保守序列,设计合成1对针对PToV的特异性引物,建立了基于SYBR GreenⅡ检测PToV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能很好地将PToV与猪伪狂犬病病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、A群猪轮状病毒、猪瘟病毒、沙门菌和大肠杆菌区分开来,特异性强。检测PToV的N基因在8.65×101~8.65×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.998 9,扩增产物的熔解曲线分析只有1个单特异峰。所建立的实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.29%~1.30%,组间变异系数为0.45%~1.80%,重复性较好。利用该方法对采集自四川部分地区的43份临床样品进行检测,实时荧光定量RTPCR检出13份阳性样品,与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结果表明建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性较强、灵敏度高,可用于该病的临床检测和流行病学调查。     

猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。     

猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析

为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。     

城镇化战略:农村职业教育的发展机遇和挑战

城镇化战略中,农村富余劳动力大转移为农村职业教育带来了发展机遇和挑战。农村职业教育只有与时俱进,以创新的姿态谋求办学形式、办学层次、专业结构、师资结构的变革,成为农村富余劳动力合理有序转移的平台。既为三农服务,又推动自身发展。     

PRRSV体外感染Marc-145细胞对NF-κB p65/p50转录时相及核易位的影响

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染对细胞核转录因子-κB(NF-κB,p65/p50)mRNA转录时相及核易位的影响,探讨PRRSV感染导致的免疫抑制与NF-κB的活化异常是否有一定的相关性,运用实时荧光定量PCR技术对PRRSV感染Marc-145细胞不同时期NF-κB p50、p65mRNA的转录水平变化进行定量分析,并提取不同感染时期Marc-145细胞核蛋白,利用免疫印迹法检测细胞核内具有活性的p50、p65水平变化。荧光定量结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第8～12小时,p50、p65转录水平急剧下调,第12～120小时p50、p65mRNA含量一直维持在较低水平,与接毒前及对照组同时期的转录水平相比,差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)。免疫印迹结果表明,Marc-145细胞感染PRRSV后第12～96小时,细胞核内均未检测到p50的表达;感染后第12小时,细胞核内p65表达下调,第48～96小时未检测到p65的表达。可见,PRRSV体外感染Marc-145细胞能够抑制NF-κB p65/p50mRNA的转录及核易位。以上结果支持PRRSV感染早期无力的先天性免疫应答可能与NF-κB活化水平的低下有关的观点,为进一步研究PRRS的感染机制及NF-κB的功能提供新的思路和依据。     

猪A群轮状病毒和C群轮状病毒以及猪星状病毒多重RT-PCR同时检测方法的建立及应用

为建立同时快速检测猪A群轮状病毒(GARV)、猪C群轮状病毒(GCRV)和猪星状病毒(AstV)的三重RT-PCR检测方法,根据GenBank中公布的序列进行病毒基因区同源性分析,然后使用Primer Premier 5.0软件分别设计了GARV、GCRV的VP6基因和AstV的ORF2基因特异性引物,预期扩增片段的大小分别为229、166和410bp。在这3种病毒单项RT-PCR技术的基础上,建立了GARV、GCRV和AstV的多重RT-PCR检测方法,并用该方法检测30份四川省仔猪腹泻粪样。结果显示,GARV、GCRV、AstV的阳性检出率分别为26.7%、13.3%、16.7%,本方法与这3种病毒的单项RT-PCR检测结果的符合率分别为100%、100%、83%,整体符合率达94.3%,特异性为100%。结果表明,本试验建立的多重RTPCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于GARV、GCRV和AstV的同时检测。     

塞内卡病毒A SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为深入研究塞内卡病毒A的病原学及流行病学,本研究分离获得了 1株塞内卡病毒A的重庆地区毒株并将其命名为SVA-XN2021.针对VP1基因,设计了 1对特异性引物,将SVA-XN2021株编码区克隆入载体pcDNA3.1(+),构建了以重组标准阳性质粒pcDNA3.1(+)-SVA为模板的SVA的SYBR Green ...     

猪博卡病毒双重PCR检测方法的建立及其应用

为了建立快速检测猪博卡病毒(PBoV)所有基因型的诊断方法,根据GenBank中公布的PBoV的不同基因型序列,对其进行同源性分析,分别设计出扩增PBoV1/PBoV2及PBoV3/PBoV4/PBoV5的引物,在分别建立单一PCR检测方法的基础上,通过对两组引物的比例、退火温度等条件的优化,首次建立了同时检测PBoV1/PBoV2和PBoV3/PBoV4/PBoV5的双重PCR方法。使用该方法对来自四川省部分猪场的18份腹泻仔猪病料进行检测。结果显示,建立的双重PCR特异性强,敏感性高,重复性好;四川省存在猪博卡病毒感染,样品中有10份为猪博卡病毒阳性,其中7份为猪博卡病毒3/4/5型,2份为猪博卡病毒1/2型,1份为猪博卡病毒1/2型及3/4/5型共感染。结果表明,建立的双重PCR能成功检测出猪博卡病毒所有基因型,并能区分PBoV1/PBoV2和PBoV3/PBoV4/PBoV5,为猪博卡病毒的诊断和预防提供了技术支持。