布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——布氏锥虫伊氏亚种的纯净培养

用无细胞培养系统培养我国3株水牛源布氏锥虫伊氏亚种取得成功。从开始培养的第7天起,向虫数已很少且不增殖的培养物中逐日补种少量滋养层细胞系统培养的培养日龄相同的同株锥虫,于10～17天间逐步建立了适应于无细胞系统的锥虫群体。整个适应过程可分为4个阶段——一过性生长期、生长停滞期、初步适应期和完全适应期。至今已连续培养9个月,虫密度一般保持在1×10~6/ml左右,最高可达1.9×10~6/ml。锥虫在培养物内有规律地呈现岛屿状密集分布。长期培养的锥虫仍保持单一细长形态,具表面被膜、对小白鼠有致病力。对已适应于无细胞系统的锥虫,成功地进行了克隆、冻存、复苏后可直接继续培养。实验表明,培养液中2-ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mmol和20％,添加0.1mmol次黄嘌呤可使虫密度增加约1倍。用烛罐可取代CO_2-培养箱。基础培养基贮存于-20℃,至少可使用76天。     

伊氏锥虫抗原变异型及其优势代表变异体的分离鉴定

以连续克隆分离的方法,从1株水牛伊氏锥虫中分离到40个克隆群体,从中分离鉴定出18个抗原变异型.经间接免疫荧光试验检测,发现其中2个抗原变异型(即HbTatl.18和HbTatl.15)分别能与约80%和60%克隆群体的血清发生较强的阳性反应,初步确定这2个抗原变异型为该虫株的优势代表变异体.这为伊氏锥虫免疫预防、免疫诊断、分子诊断以及遗传进化等的研究奠定了良好的基础.     

分泌抗布氏锥虫群共同抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用DEAE-纤维素分离的布氏锥虫伊氏亚种JG克隆株虫体按Segura 氏法制备抗原,常规免疫BALB/c鼠、融合、筛选和克隆。筛选时除使用免疫抗原外,还使用按同法制备的我国不同地区分离的3株布氏锥虫伊氏亚种(JX、ZJ、GY株),1个布氏锥虫马媾疫亚种虫株和培养的1株布氏锥虫指名亚种发育前期型虫体的抗原,以及泰氏锥虫和弓形虫抗原。共获得8个杂交瘤细胞株(4A_(11)、2D_6、5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6。它们分泌的单克隆抗体与泰氏锥虫、弓形虫抗原均无反应。4A_(11)、2D_6在ELISA和间接免疫荧光试验中只与免疫克隆株抗原反应。其余6株在ELISA中不仅与免疫株抗原反应,而且与其他锥虫虫株抗原呈明显交叉反应,免疫荧光试验则全部阴性。在ID试验中,1C_9、1F_(11)腹水与上述6种抗原呈现明显沉淀线,另6株则均无反应。4A_(11)和2D_6是针对伊氏锥虫群JG克隆株特异抗原,而5C_8、2E_3、1H_8、1C_9、1F_(11)、4F_6则是抗布氏锥虫群共同抗原。     

锥虫不同分离株克隆及其等电聚焦分析

将两个伊氏锥虫及一个马媾疫锥虫的不同分离株分别接种用环磷 酰胺处理的小鼠,获得五个克隆,用等电聚焦比较其蛋白质差异。结果表 明,三个分离株之间有明显区别;马媾疫锥虫显著不同于伊氏锥虫;分离株 不同克隆间区别较小,其中广东水牛株两克隆间带型相同,安徽水牛株两克隆间带型略有区别。证明伊氏锥虫克隆间变异较小,锥虫不同分离株间变异较大,马媾疫锥虫与伊氏锥虫之间变异最大。     

布氏锥虫伊氏亚种体外药敏试验

应用布氏锥虫伊氏亚种(Trypanosoma brucei evansi,T.b.e)体外药敏试验系统检查了国内6个T.b.e虫株和国外布氏锥虫指名亚种(T.b.b)对苏拉灭(Suramin)、贝尼尔(Berenil)、安锥赛(Antrycide)、咪唑苯脲(Imidocard)和硫胂聚氰胺(Cymelarsan)等5种抗锥虫药的敏感性。结果表明,该系统能准确测定不同虫株对各种药物的敏感性,与小鼠治疗试验结果基本相符,发现了国内抗贝尼尔和苏拉灭的T.b.e虫株。     

中国伊氏锥虫不同虫株免疫抗原差异性试验

中国伊氏锥虫不同虫株免疫抗原差异性试验１）周金林沈杰王云飞周勇志石滨海（中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所２００２３２）伊氏锥虫在长期进化过程中，形成众多虫株，在进行免疫诊断时，用某株锥虫制成的抗原对其他株锥虫病的特异性不相同。王祥生等（１９８８）...     

钴~(60)γ射线照射伊氏锥虫免疫试验

家畜伊氏锥虫病广泛流行于我国南方,在湖北省相当严重。1973年宜城等6个县锥虫病大爆发,患病牛、马达8241头,死亡5288头,经济损失约211万元。为控制本病流行,除用药物治疗外,并以免疫方面进行了研究。1975年Fregene等以~(137)CS照射布氏锥虫与冈保锥虫,布氏锥虫照射剂量为4.60±0.12仟拉得,冈保锥虫为2.9仟拉得,10～20天以后以10~4同源虫株攻击,前者保护存活为74.3％,后者为31.7％。但伊氏锥虫免疫效果如何,未见报道。为此,我们进行锥虫免疫试验研究。     

伊氏锥虫 布氏锥虫和马媾疫锥虫对锥46的药敏试验

在我国,伊氏锥虫病流行 极广,达二十多个省区,对畜牧业生产危害极大。长期以来,伊氏锥虫病的治疗主要依赖为数甚少的几种药物,导致抗药虫株的产生,从而给该病的防治带来新的困难(沈杰等,1991;方元等,1992),急待高效新药产生。为了解决这一问题,上海家畜寄生虫病研究所与上海医药工业研究院合作,成功地合成、筛选了一种抗锥虫新药——雄46(T46)。确定伊氏锥虫对其的药敏性,为锥46的临床应用奠定合理的用药理论基础是十分必要的。本试验通过体内(小鼠治疗)和体外(人工培养)的方法检测了伊氏锥虫布氏锥虫和马媾疫锥虫对锥46的敏感性。     

伊氏锥虫动基体DNA微环的克隆

把伊氏锥虫云南株动基体DNA微环重组于puc19质粒载体,转化入大肠杆菌JM103菌株,获得KDNA全微环克隆。用α-~(32)P-dATP经缺口翻译标记的重组质粒(PTK)能与伊氏锥虫及其KDNA杂交,而不与核DNA杂交。该质粒探针具有高度的敏感性,能检测出10pg的KDNA和100个锥虫体,是快速鉴定伊氏锥虫的理想工具。     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤株的建立

本试验以DEAE纤维柱层析法从感染小鼠血液中分离得纯净锥虫,再通过超声乳化,制备锥虫可溶性抗原,用其免疫BALB/c小鼠,再以此BALB/c小鼠脾细胞与SP_2/o骨髓瘤细胞融合,采用Dot-ELISA和间接ELISA法筛选出7株分泌针对伊氏锥虫的单克隆抗体的杂交瘤株(IH_(10)、AE_7、EB_6、BE_5、AG_(11)、BA_5、GB_6),实验结果表明,间接ELISA和Dot-ELISA符合率良好。分泌的7种克隆抗体有5株属于IgG_1,2株属于IgG_(2a);用阴性血清封闭试验及交互抑制试验证实7株单抗都是针对伊氏锥虫的,并证明是针对不同决定簇的。     

补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS-1株接种除脾易感牛,制备出补反诊断抗原。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,并建立了总量为0.6ml的补反诊断方法。对试验条件下人工感染牛的补反检出率为100％,安全区无假阳性反应。人工感染牛第5天出现补反抗体,感染后20～50天血清抗体达到高峰,以后开始下降,7个月后补反抗体消失。所制备的补反抗原与双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫,环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、伊氏锥虫和日本血吸虫等几种血液寄生虫抗血清之间没有交叉反应。抗原保存期达一年以上。所制备的抗原达到了国外同类产品的水平。     

微量补体结合试验诊断边虫感染牛的研究

利用边缘边虫DS—1株接种除脾易感牛,制备出补体结合试验诊断抗原,并建立了边虫感染牛总量为0.2ml的微量补反诊断法。所制备的抗原具有良好的特异性和敏感性,对实验室条件下人工感染牛的补反检查,符合率为100％;自然条件下感染牛补反检查的符合率为92.3％;安全区牛无假阳性反应。人工感染牛于第10天可测出补反抗体,30～40天抗体滴度达到高峰,60天后开始下降。边虫补反抗原与瑟氏泰勒虫、双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、伊氏锥虫、肝片吸虫、日本裂体吸虫感染牛血清无交叉反应,与正常红细胞免疫牛血清反应为阴性结果。     

鸡源火鸡组织滴虫JSYZ-A株的分离与鉴定

对组织滴虫病临床发病鸡的肝和盲肠进行了虫体的分离及体外培养,通过形态学和基于18S rRNA的分子生物学方法进行了鉴定,并采用连续稀释法进行了克隆和建株。结果表明,采用含有马血清和米粉以及抗生素的M 199培养基,从病鸡盲肠中能分离到芽囊原虫、鸡四毛滴虫和火鸡组织滴虫,盲肠中混合感染且难以分离纯化单一虫种;从病鸡肝中能成功分离到火鸡组织滴虫单一虫种;通过有限稀释法成功获得了火鸡组织滴虫的单个克隆虫株,命名为JSYZ-A株。将分离的虫株通过泄殖腔回归接种14日龄黄羽肉鸡,成功复制出了组织滴虫病。本研究结果为进一步开展虫体致病机制、药物筛选和疫苗研制奠定了很好的基础。     

用小鼠肠淋巴结淋巴细胞制备抗日本血吸虫单克隆抗体

应用感染血吸虫尾蚴11周的Balb/c小鼠肠淋巴结淋巴细胞建立16株血吸虫虫卵抗原特异性的单克隆抗体,选择其中的8株进行扩大培养并进行特性测定。双向琼脂扩散试验表明8株单抗都属IgG_1亚型。ELISA试验表明8株单抗都只对血吸虫虫卵抗原起反应,对肝片吸虫抗原和锥虫抗原都不起交叉反应。血吸虫雄虫和虫卵冰冻切片IFA试验表明8株单抗都定位于虫卵卵壳,其中1株同时定位于雄虫表膜,2株同时定位于雄虫肠壁。免疫电转移试验表明8株单抗都能识别血吸虫虫卵抗原55～98KD之间的多条抗原条带,其中有3株单抗同时识别雄虫抗原的1～2条抗原条带。ADCC试验表明在巨噬细胞或嗜酸性粒细胞介导下,8株单抗中有7株杀伤血吸虫童虫的效果比1:2稀释的、感染血吸虫尾蚴8周的Balb/c小鼠血清强。     

三株牛瑟氏泰勒虫P32表面蛋白基因的克隆与序列分析

为分析我国分离的3株牛瑟氏泰勒虫P32基因序列,根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫P32表面蛋白基因序列设计合成1对引物,用PCR方法分别扩增出牛瑟氏泰勒虫辽阳株、宁县株和汶川株的P32基因片段,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-T Easy载体上,将经PCR鉴定和EcoR Ⅰ酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序.结果表明,克隆的这3株牛瑟氏泰勒虫P32基因片段长度均为875 bp,编码283个氨基酸.核苷酸同源性分析表明,该基因辽阳株与宁县株的同源性最高,为99.4%,汶川株与这2株的同源性分别是92.1%和91.9%,而我国辽阳株与日本株(AB016280)、俄罗斯株(AB016279)的同源性较高,分别为99.8%和99.6%.     

我国羊巴贝斯虫bov57基因的结构与遗传进化分析

通过对我国羊巴贝斯虫bov57基因进行克隆、序列比对和进化分析,为研究bov57基因功能及我国羊巴贝斯虫分类提供基础数据支持。以NCBI数据库中公布的卵形巴贝斯虫和牛巴贝斯虫bov57基因序列BLAST我国2个羊巴贝斯虫基因组数据库,获得羊巴贝斯虫bov57基因的保守序列,以此为模板设计引物;扩增我国6株羊巴贝斯虫的bov57基因,分析其结构特征,并进行序列比对,构建系统进化树,分析遗传进化关系。结果显示,这6株羊巴贝斯虫bov57基因均无内含子,羊巴贝斯虫未定种敦煌株/新疆株(BspDH/XJ)和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株(Bm LT/TZ)bov57基因ORF的大小为1 608 bp,编码536个氨基酸;莫氏巴贝斯虫河北株/宁县株(Bm HB/NX)bov57基因ORF的大小为1 605 bp,编码535个氨基酸。序列比对结果显示,羊巴贝斯虫未定种与莫氏巴贝斯虫bov57基因核苷酸序列的相似性为58.84%～61.71%,氨基酸序列的相似性为45.93%～50.93%;莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株和莫氏巴贝斯虫河北株/宁县株的核苷酸序列相似性为85.29%～85.60%,氨基酸序列相似性为75.19%～75.74%。遗传进化分析结果表明,我国的这6株羊巴贝斯虫分为2个种,而莫氏巴贝斯虫可能存在2个亚种。     

伊氏锥虫体外培养的研究

用鼠体继代的水牛伊氏锥虫进行体外培养。经试验证实,以RPMI_(1640)加入20mmolHEPES、2mmol L-谷氨酰胺、2mmol L-苏氨酸、1.5mg/mlD-葡萄糖、0.5％水解乳蛋白(LH)及10％灭活犊牛血清组成的CM_3培养基,并以牛睾丸原代细胞为饲养层细胞效果最好,在37℃下可较好地支持伊氏锥虫的生长,接种虫体起始浓度为10~5/ml左右,可于第2天增至10~6/ml,并可维持该浓度达5天之久,从第6天开始,虫体逐渐减少,虫体可在该系统中存活14天,将培养12天的培养物接种小鼠,对小鼠致病性不变,同时还测定了HEPES、D-葡萄糖、培养不同时间的细胞单层、虫体不同接种浓度等对锥虫体外培养的影响。     

唾传锥虫脊椎动物型的体外培养

(一)研究历史 唾传锥虫体外培养技术的发展可分为三个阶段。从1903年Novy和MacNeal首次培养布氏锥虫指名亚种(Trypanosomabru-cei brucei,T.b)至1976年,为第一阶段;此期间只能培养T.b和刚果锥虫(T.con-golense,T.con)无感染性的前循环型。1977～1985年为第二阶段。1977年Hirumi等以有哺乳动物细胞滋养层的培养系统培养T.b.脊椎动物型取得成功,这一突破是唾传锥虫体外培养进入迅速发     

应用IHA检测实验感染伊氏锥虫山羊血清抗体的消长动态

早在1941年,印度的Kuppaswamy就通过研究认为山羊与牛都可以看作是伊氏锥虫的保虫宿主。本研究的目的是,应用间接血凝试验(IHA)来检测人工感染伊氏锥虫的山羊血液中抗体变化的规律,从而为山羊感染伊氏锥虫的血清学诊断提供必要的理论依据。     

家畜伊氏锥虫多因素致弱苗免疫试验观察

用伊氏锥虫多因素致弱苗免疫小白鼠３０只，在免疫后３０，４５，６０ｄ各取１０只小白鼠攻虫，保护率依次为９／１０，８／１０，６／１０；３次空白对照小白鼠均于注锥虫后４～７ｄ死亡。免疫豚鼠３０只，在免疫后３０，６０，９０ｄ各取１０只豚鼠攻虫，保护率依次为１０／１０，９／１０，８／１０；３次空白对照豚鼠均于注锥虫后１７～２３ｄ死亡。免疫马９匹，在免疫后３０，６０，９０ｄ各取３匹马攻虫，均获３／３保护；继续观察至１１个月，免疫后攻虫马均正常，镜检阴性，动物试验阴性；３次空白对照马均在注锥虫后４５～５０ｄ死亡。