甘肃省部分地区牛皮蝇蛆病的流行病学调查

为掌握牛皮蝇蛆病在甘肃地区的流行动态,2003～2005年在甘肃省玛曲县、天祝县、平凉市崆峒区的3个屠宰场剖检1 827头牛.结果发现,这3个县(区)均有牛皮蝇蛆病的感染,其中,玛曲县、平凉市崆峒区的皮蝇2期幼虫在牛食管的寄生率以10月份为最高,分别为48.5%和7.8%.表明,药物防治的最佳时间为10月份.     

微小牛蜱Bm91基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bin91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物.采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoR I酶切位点,构建重组表达载体pPIC9K-Bm91.再次测序正确后将其用Sac Ⅰ内切酶线性化,电转化毕赤酵母GS115并经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,Bm91基因获得了成功表达,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的83 ku的重组Bm91蛋白.     

黑龙江尚志地区莱姆病伯氏疏螺旋体的鉴定与遗传进化分析

自我国黑龙江省尚志市野外采集的蜱体内分离出1株莱姆病伯氏疏螺旋体,并对其进行了形态观察及分子生物学分析。利用BSK H分离培养法,经暗视野显微镜和姬姆萨染色观察,菌体呈螺旋状。根据已报道的伯氏疏螺旋体16S rRNA基因序列设计引物,结合参考文献设计的外膜蛋白A(OspA)基因引物经PCR扩增并测序,与GenBank中的各种伯氏疏螺旋体基因型建立系统发生树并进行同源性分析。结果表明,16S rRNA基因核苷酸序列与GenBank中的伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)DK27(X85193)具有较高的同源性,可达99.5%;OspA基因核苷酸序列与报道的Borrelia gariniiKhab(AY502600)有较高的同源性,为93.6%。根据序列分析结果,认为该分离株属于Borrelia garinii基因型,命名为SZ,该菌株16SrRNA基因和OspA基因核酸序列已提交到GenBank(登录号分别为HM007279和HM007278)。     

残缘璃眼蜱人工培育及对环形泰勒虫的实验性传播

将采自内蒙古自治区的残缘璃眼蜱(Hyalomma detritum)饲喂于牛体,观察了成虫、幼虫、若虫在实验室饲喂条件下的生活周期及滞育现象;通过蜱传播试验证实,残缘璃眼蜱饥饿幼虫、若虫吸入病原,其蜕化之若虫、成虫能将环形泰勒虫(Theileria annulata)传播给敏感动物,而幼虫阶段吸入病原,如若虫阶段在兔体饱血,所蜕化产生的饥饿成虫不传播该病.     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

羊泰勒虫病人工感染试验

在实验室条件下用采自甘肃省临潭县的青海血蜱饥饿成蜱人工叮咬绵羊,使其感染泰勒虫并发病,观察其虫血症、临床表现、血液学变化及病理剖检变化.结果,试验羊普遍出现稽留热、贫血、体表淋巴结肿胀等症状;血红蛋白含量从85 g/L降到40 g/L,红细胞总数从12.0×1012降到1.5×1012;内脏器官有不同程度地肿胀、出血;本病的潜伏期为22-28 d,红细胞染虫率最高可达39%.     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。     

羊源巴贝斯虫未定种甘肃敦煌株的发现

采用动物接种法将采自甘肃敦煌的15只绵羊血液混合后感染1只除脾绵羊,感染后逐日做血涂片检查。结果显示,在感染后第10天的血片上出现了1种大型巴贝斯虫。虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形为主。在感染后第12天,感染羊体温升至41.1℃。染虫率达到0.125%,之后逐渐下降。无菌采集该羊血液,提取全血基因组,用梨形虫通用引物进行PCR扩增全长18SrRNA基因,得到长约1 700bp的片段,将其克隆并测序(登录号:HQ730762),与GenBank中的其他巴贝斯虫的序列进行比较,发现其与新疆巴贝斯虫未定种的同源性最高,达到99.8%。本研究发现甘肃敦煌又是一个新疆羊巴贝斯虫未定种的疫源地。     

伯氏疏螺旋体外膜蛋白C的表达及抗原性分析

以伯氏疏螺旋体SZ(B.garinii)、BO23(B.afzelii)、B31(B.burgdorferi sensu stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,将PCR扩增出的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒进行表达,表达的蛋白用MagneGSTTMProtein Purification System纯化,之后用此3株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western-blot,检测该重组蛋白。证明这3个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应性。本研究表达的重组蛋白OspC(SZ菌株)为建立羊体内伯氏疏螺旋体抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

八种杀蜱药物与球孢白僵菌分生孢子的生物相容性

为探索绿色高效的杀蜱新制剂,采用营养液萌发法和平板生长法测定了8种杀蜱药物与球孢白僵菌分生孢子的生物相容性.结果显示,这8种药物与白僵菌的相客性和药物浓度呈负相关,次亚致死剂量的苦皮藤素、灭幼脲和溴氰菊酯与白僵菌的相容性良好,萌发率均在85%以上;用浸渍法测得白僵菌孢子浓度在1×107/mL时对蜱的致死率可达100%.结果表明,所试验的8种药物中,苦皮藤素、灭幼脲和溴氰菊酯可与白僵菌配伍使用;白僵菌的最佳使用浓度为1×107/mL.