马立克病病毒1型LZ1309株的分离鉴定与生物特性分析

从免疫马立克病(MD)HVT和CVI988疫苗的甘肃某规模化鸡场采集MD阳性病鸡抗凝全血,分离淋巴细胞,接种于鸡胚成纤维细胞,分离出1株马立克病病毒(MDV)。病毒蚀斑纯化后经PCR和间接免疫荧光鉴定,该毒株为MDV1型毒株,命名为LZ1309株。PCR扩增并测序致瘤基因meq。核苷酸同源性分析结果显示,与国内分离株LS株的同源性最高(99.9%),与CVI988株的同源性最低(98.8%)。氨基酸序列分析显示,氨基酸突变位点符合国内强毒株的特征。为掌握LZ1309株的致病力,进行了LZ1309株攻毒试验。结果显示,LZ1309株攻毒组鸡的死亡率为13.3%,攻毒组鸡体重显著降低,肝、脾、腺胃乳头和心脏均出现肿瘤结节,胸腺和法氏囊严重萎缩。PCR检测攻毒鸡的器官组织,均能扩增到MDV1型强毒株meq基因的特异性条带。本研究成功分离鉴定出1株MDV强毒株,此结果为研究国内MDV毒力演化、致病机理和疫苗研发奠定了重要基础。     

鸡马立克氏病病毒HC135分离株的致病性

从辽宁省某鸡场疑似马立克氏病发病鸡外周血淋巴细胞中分离到1株适应鸭胚成纤维细胞生长的马立克氏病病毒(MDV),经蚀斑克隆和细胞传代,成功培育了1株增殖性能稳定的MDV细胞毒株,命名为HC135株;将HC135株第4代细胞培养物分别人工感染非免疫和不同疫苗免疫的SPF鸡,分析其对鸡的致病力,分离毒株攻毒对照组鸡的发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10);HVT疫苗及HVT/SB1双价疫苗对分离毒株的保护指数分别为22.2和40.0。结果表明,该毒株可以突破HVT疫苗和HVT/SB1双价疫苗的免疫保护,具有特超强毒株(vv+MDV)的特点;也证实了我国商品鸡群中存在vv+MDV毒株。同时比较了HC135株与14株参考毒株的Meq基因序列,发现其Meq基因的ORF内没有基因片段的插入或缺失,推导的氨基酸存在点突变,这种突变符合高毒力毒株的变异规律。     

鸡马立克氏病鸡胚免疫接种的研究

本试验对鸡马立克氏病(MD)的火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗接种鸡胚的安全性和免疫保护等进行了初步的探讨。试验表明:18日龄鸡胚接种HVT疫苗对孵化无不良影响,与1日龄 雏鸡接种HVT疫苗比较,鸡胚免疫后较早产生免疫保护,用MD强毒(BJ—1株)腹腔内接种攻击后,保护率明显提高。     

表达MDV-gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

将马立克氏病病毒 (MDV ) gB基因插入鸡痘病毒中 ,构建了含有MDV gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV ) ,用rFPV、火鸡疱疹病毒 (HVT)冻干疫苗、rFPV HVT二联疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明 ,3种疫苗均诱导了免疫应答 ,免疫保护率分别为 69%、69%和 85 %。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当 ,二者联用具有免疫协同作用。     

马立克病毒感染鸡端粒酶活性的研究

对1日龄非免疫鸡分别接种马立克病病毒(MDV)Ⅰ型国际标准强毒GA株、国内标准强毒京1株及Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株后第5d起,用改进的TRAP法和Bandscan软件测定分析、计算感染过程中鸡外周血淋巴细胞(PBMC)的端粒酶活性。结果,自接种MDVⅠ型强毒GA株和京1株后,在鸡尚未出现临床症状和可视病变之前端粒酶就可被检测到,并且随着感染鸡日龄的增加逐渐升高,分别在20～25日龄时其相对活力达到最高值;接种MDVCVI988后,整个试验期端粒酶活性均呈阴性。试验结果表明,MDVCVI988疫苗株具有较可靠的免疫效果,PBMC端粒酶活性与马立克病的发病进程具有一定的相关性。     

MDV-gB重组痘苗病毒诱导免疫的检测及保护性

用MDV gB重组痘苗病毒RVV gB、HVT冻干疫苗、痘苗病毒WR株分别按试验程序对细胞免疫及体液免疫检测试验中的 1日龄SPF鸡进行免疫接种 ,并于 15日龄时对试验各组鸡用GA株强毒攻击 ,经IFA抗体检测 ,及以PHA为有丝分裂原的淋巴细胞转化检测 ,结果表明 ,重组病毒和HVT冻干疫苗免疫鸡均获得了较高保护 ,体液免疫效果差异不显著 ;细胞免疫效果在攻毒前差异不显著 ,但攻毒后第 2d开始 ,RVV gB免疫组鸡的淋巴细胞转化率明显高于HVT冻干疫苗免疫组鸡。     

马立克氏病病毒和火鸡疱疹病毒的基因分析

马立克氏病(MD)是鸡的一种高度传染性的淋巴组织增生性疾病,致病因子是疱疹病毒科的马立克氏病病毒(MDV)。根据免疫荧光试验、琼脂凝胶扩散试验、病毒中和试验以及特异的单抗的结合反应性,将MDV分成3个血清型:血清Ⅰ型包括引起高发性内脏、神经肿瘤的古典型MDV     

检测马立克氏病血清型特异性单克隆抗体的酶联免疫吸附试验

马立克氏病(MD)是由疱疹病毒科马立克氏病毒(MDV)引起鸡内脏淋巴瘤和外周神经淋巴增生为特征的传染性疾病。根据免疫荧光抗体(IFA)试验;免疫扩散(ID)试验和血清中和(SN)试验等血清学方法,Bullow和Biggs将MDV分为三个不同血清型:血清1型病毒,包括致病性毒抹和它们的减毒弱毒株、血清2型病毒是非致病性MDV毒抹;血清3型病毒,包括所有的火鸡疱疹病毒     

鸡马立克氏病二价疫苗田间免疫效力试验

最近几年来,我们使用黄仕霞等从我国土种鸡中首次分离到的非致瘤性血清Ⅱ型马立克氏病病毒(MDV)Z4毒株(病毒学报,1988,4(2),131～135)与火鸡疱疹病毒(HVT)制成二价苗(Z4 HVT)。经实验室试验,证明该二价苗具有良好的免疫性能,达到国外同类产品SB1 HVT二价苗的水平。为了评价Z4 HVT二价苗预防MD的田间免疫效果,特进行了本试验。     

广西玉林地区MDV强毒YL2002株的分离鉴定

广西玉林地区鸡马立克氏病(MD)疫苗免疫鸡群出现MD疫情,笔者从出现MD疫情的规模化肉鸡养殖场采集抗凝血,分离得到MDV野毒株,鉴定为血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV),命名为YL2002。与15株参考毒株进行比对,meq基因核苷酸同源性分析结果显示,YL2002株与JS201801株MDV同源性最高,为100%;与648A株同源性最低,为98.6%。将分离得到的MDV野毒株回归动物实验,分析其对肉鸡品种黄鸡2号的致病性,该分离株攻毒组发病鸡出现瘫痪症状,并发现心脏、肝肿瘤。病理组织学观察可见各组织出现淋巴细胞增生和浸润。致病性结果显示,YL2002攻毒组发病率和死亡率为100%和69.2%。本试验成功分离得到1株MDV强毒株,为广西玉林地区频发的马立克氏病疫情的防控提供了理论基础,也为我国MDV的毒力演化研究提供了参考。     

马立克氏病疫苗免疫增强剂对雏鸡血液T淋巴细胞数量的影响

观察了马立克氏病(MD)疫苗免疫增强剂配合火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗免疫雏鸡后外周血清ANAE+T淋巴细胞数量的变化.结果表明,MD疫苗免疫增强剂不但可促进外周血液ANAE+T淋巴细胞总数的增多,而且对免疫早期T淋巴细胞的迅速增殖和辅助性T淋巴细胞数量的增多都有十分明显的作用.     

免疫鸡群发生马立克病的诊断与病理学研究

采用琼脂扩散试验、PCR和病理组织学观察分别对疑似马立克病(MD)病鸡进行确诊和病理学研究。结果显示,琼脂扩散试验中马立克病病毒(MDV1)抗原呈阳性;PCR扩增出567bp的MDV1特异性片段。病理学观察显示,肝、脾、肾和心程度不等肿大,色泽变淡,形成有大小不等和数量不一的灰白色结节。部分病鸡坐骨神经呈单侧性不规则肿粗,弹性降低或丧失。病鸡实质器官及坐骨神经组织中均出现大量多形态的类似淋巴细胞、成淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞及网状细胞的肿瘤细胞聚集和散在,并可见典型的MD细胞,尤其在血管周围和淋巴管周围。各型肿瘤细胞和MD细胞异型性明显,肿瘤细胞周围实质程度不等的变性、坏死,间质水肿。核仁区嗜银蛋白染色结果显示,肿瘤细胞增生活跃,恶性程度较高。     

鸡新城疫马立克病二联苗的研制

疫苗联合同时接种,很早以前就被成功地采用了。美国维兰公司出产的禽病疫苗及荷兰出售的禽病疫苗,为二联苗和五联苗。据此,我们引用荷兰鸡新城疫弱毒克隆株(H.Clone30)和我国现引的火鸡疮疹病毒株(HVT),分别以鸡胚和鸡胚细胞复制后,联合干燥制成二联苗,即鸡新城疫马立克病弱毒冻干二联苗。(一)材料与方法1.毒株:①H.Clone30F_6克隆株,血凝价达1:1280(鸡胚复制);②鸡马立克火鸡疙疹病毒HVT FC126干燥株;③强毒株:F_(48)E_(48);④稀释液:马立克病毒稀释液SPGA加4％血清。2.病毒的增殖与收获:(1)H.C30株:以灭菌盐水将H.C30病毒稀释成10~(-4)接种于9～10日龄的健康鸡胚(CE),每只尿囊腔接种0.2ml,于37℃温箱中继续孵育,每日检查2次。鸡胚接种后72小时以前死亡者弃     

马立克病病毒单克隆抗体的制备

以纯化的经鸡胚成纤维细胞(CEF)培养的马立克病病毒(MDV)超强毒株GX0101病毒粒子作为免疫原,制备特异性识别MDV的单克隆抗体。GX0101感染CEF后第96小时收集细胞并反复冻融3次,离心取上清,选用100 ku的切向流超滤离心管浓缩,浓缩液通过Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶作为层析介质分离纯化MDV病毒粒子,聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR分析不同收集峰MDV病毒含量,并经过透射电子显微镜观察到直径约100 nm的MDV病毒粒子。进一步用100 ku的切向流超滤离心管浓缩,制备峰尖病毒浓缩液,以此免疫雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和Western-blot筛选,最终获得107个阳性克隆,由其中1株强阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株10B2制备的单克隆抗体腹水IPMA效价为1∶2.56×10~6。本研究结果为后续MDV单克隆抗体的筛选、鉴定及诊断试剂研发奠定了重要基础。     

鸡马立克氏病肿瘤组织端粒酶活性的测定

用鸡马立克氏病病毒( MDV) 京1 株血毒对2 日龄SPF 鸡攻毒,40 d 后剖杀取部分内脏组织,一部分做病理切片,发现有肿瘤细胞浸润者判定为阳性;另一部分组织利用TRAP ( Telom eric repeat am plification protocol) 法进行端粒酶活性测定。结果发现有肿瘤细胞浸润的肾、肝、脾、神经、卵巢、精巢等组织细胞端粒酶活性非常高,且其阳性率与肿瘤细胞浸润的阳性率吻合。     

两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病(MD)流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒(MDV)Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析.结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%～100%,与MDV Ⅰ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%～99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致.提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征.     

马立克氏病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了获得分泌抗鸡马立克氏病病毒(MDV)gE囊膜糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,将pGEX-6P-1表达的重组蛋白gE作为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术,共筛选获得4株能够稳定分泌抗MDV gE蛋白抗体的杂交瘤细胞株。抗体亚型鉴定结果表明,4株均为IgG1型,轻链为κ链。间接免疫荧光结果显示,4株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均能特异性识别MDV,并具有一定的中和活性。本研究对MDV诊断、抗原表位分析及鉴定等具有重要的应用价值。     

电子显微镜检测马立克氏病病毒的研究

摘要本文利用电镜技术检测了马立克氏病疫苗或其种毒复壮及传代过程中的鸡胚成纤维细胞培养物。其结果:①马立克氏病病毒是目的毒,其直径约150nm,但数量不多;②RNA肿瘤病毒(C型粒子),常见于鸡体内,我国约有90％以上的鸡体中都有此病毒;③霉形体;④细菌;⑤网状内皮增生症病毒样粒子,其直径约90nm,形态呈炸面圈样。在细胞原生质膜上以“出芽”方式释放病毒。该病毒非常容易混入马立克氏病疫苗中,通过预防接种蔓延。     

鸡马立克病毒野毒株在鸭胚成纤维细胞上的培育及鉴定

用2006～2007年从现地采集的疑似感染鸡马立克病(MD)鸡羽髓分别接种鸭胚成纤维细胞(DEF),蚀斑克隆纯化后,随机选1个单克隆,再接种DEF增殖,获得9株适应DEF的鸡马立克病病毒(MDV)野毒株,分别命名为ZY、FY、SY、YC、CZ、MS、CGZ、QQHE和DH.应用PCR技术分别扩增这9株MDV的132 bp重复序列(132 bpr),发现这9株132 bpr均为2个拷贝,符合致病型MDV的特点.从分离的9株MDV中选择5株,人工感染7日龄SPF白来航鸡.试验鸡表现精神萎靡,被毛凌乱,个体瘦小;60d后剖杀,大多可见内脏肿瘤;SY、FY、QQHE 3株的MD临床阳性率达100%.     

马立克病病毒被膜蛋白VP22的研究进展

马立克病病毒(MDV)感染鸡可导致外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官肿瘤和免疫抑制。VP22蛋白是α-疱疹病毒被膜蛋白特有的成分,它具有独特的蛋白转运能力,能够将与病毒复制有关的蛋白质以及核酸等物质转运到细胞中,并且能够通过抑制cGAS-STING信号通路来帮助病毒逃避宿主的天然免疫屏障,但是VP22是否与MDV的免疫逃逸有关还未见相关报道,仍有待进一步研究。本文主要从VP22的细胞核定位、蛋白转导以及免疫逃避等方面进行综述,加深对MDV病毒蛋白VP22的认识。