噻环乙胺及小型猪复合麻醉剂(XFM)对大鼠不同脑区单胺类神经递质的影响

Wister大鼠84只,先随机抽取12只为对照组,其余随机均分为噻环乙胺组和XFM组,每组又随机均分为麻醉组、恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组3个亚组。采用荧光分光光度法分别测定各组大鼠脑区内去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)的含量。结果显示,噻环乙胺及XFM均使麻醉组大脑皮层、海马和丘脑内NE和DA的含量显著降低,5-HT的含量显著增加(P0.01);恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组中上述各脑区内NE、DA、5-HT含量均显著恢复;麻醉全过程中,小脑和脑干内NE、DA、5-HT含量均无显著变化。结果表明,噻环乙胺及XFM的中枢麻醉作用可能与降低大脑皮层、海马和丘脑内NE和DA,同时增加5-HT的含量有关。     

小型猪复合麻醉剂对大鼠不同脑区内源性阿片肽含量的影响

从128只Wista大鼠中随机抽取8只为对照组,其余随机均分为5个试验组用以分别测定L-Enk、M-Enk、β-EP、dynA和OFQ的含量,每个试验组又随机均分为麻醉组、恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组3个亚组。采用ELISA测定各脑区内源性阿片肽的含量。结果显示,腹腔注射XFM2mL/kg后,麻醉组,大脑皮层和丘脑内L-Enk、M-Enk、β-EP和dynA含量均显著增加(P0.05或P0.01),海马内L-Enk、M-Enk和β-EP含量均显著增加(P0.05或P0.01),丘脑内OFQ的含量显著降低(P0.01);恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组上述各脑区内L-Enk、M-Enk、β-EP、dynA和OFQ的含量均显著恢复(P0.05);麻醉全过程中,小脑和脑干内5种内源性阿片肽的含量均无显著变化。结果表明,XFM对不同脑区内源性阿片肽的影响可能是其产生全麻作用的重要机理之一;XFM的中枢麻醉作用可能与增加大脑皮层和丘脑内L-Enk、M-Enk、β-EP和dynA,海马内L-Enk、M-Enk和β-EP的含量,同时降低丘脑内OFQ的含量有关。     

替来他明对大鼠不同脑区NO-cGMP信号转导系统的影响

SD大鼠80只,随机均分为两组,一组测定脑NOS活性、NO产量,另一组测定脑cGMP含量.每组又随机均分为对照组、麻醉组、恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组等4个亚组.用分光光度法测定脑NOS活性和NO产量,用放射免疫法测定脑cGMP舍量.结果显示,在麻醉组不但大脑皮层、海马和丘脑的NOS活性受到明显抑制,而且显著(P＜0.05)减少上述脑区NO产量和cGMP含量.在恢复Ⅰ组上述脑区NOS活性、NO产量、cGMP含量大体呈恢复趋势,在恢复Ⅱ组呈现明显恢复.在替来他明麻醉过程中脑干、小脑的NOS活性、NO产量和cGMP含量未发生明显的变化.结果表明,替来他明麻醉作用可能与抑制大脑皮层,丘脑和海马等脑区NO-cGMP信号转导系统相关.     

垂体ghrelin mRNA和LH mRNA在大鼠发情期和间情期的表达

为了探索垂体ghrelin mRNA和LH mRNA在大鼠发情期和间情期的表达特点,将12只未经产SD雌性大鼠随机分为发情期组和间情期2组,每组6只,通过外部观察和阴道涂片相结合的方法确定发情期和间情期.动物宰杀后取垂体,用RT-PCR方法检测ghrelin mRNA和LH mRNA的表达丰度.结果显示,发情期组垂体ghrelin mRNA的表达丰度显著低于间情期组(P＜0.01);发情期组垂体LH mRNA的丰度显著高于间情期组(P＜0.01).结果表明,ghrelin可能在垂体水平上参与了对LH分泌的调节.     

氯化锰对鸡支持-生精细胞凋亡及Bak和Bcl-x基因表达的影响

为探讨氯化锰(MnCl2)对鸡支持-生精细胞凋亡及Bak、Bcl-X基因mRNA表达的影响,取对数生长期鸡支持-生精细胞,用含0、2、3、4 mmol/L MnCl2的培养液培养24 h,采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法(TUNEL)检测鸡支持-生精细胞凋亡,采用实时定量PCR检测Bak、Bcl-x基因mRNA的表达量.结果显示,MnCl2处理组细胞与对照组相比,鸡支持-生精细胞凋亡指数逐渐升高(P<0.01);Bak基因的表达量上调(P<0.01),Bcl-X基因的表达量下降(P<0.01).说明MnCl2可通过改变Bak、Bcl-X基因mRNA表达量导致鸡支持-生精细胞发生凋亡.     

感染传染性法氏囊病病毒的DF-1细胞中chTLR3表达的动态变化

为研究鸡Toll样受体3(chTLR3)基因在传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染DF-1细胞过程中的表达情况,用3种不同毒力的IBDV感染DF-1细胞,采用实时荧光定量PCR法以及间接免疫荧光法对细胞内chTLR3基因的表达情况进行了检测。结果显示,DF-1细胞感染IBDV标准株后,其chTLR3mRNA的表达量呈增长趋势,感染后第48小时mRNA表达量达到峰值(P0.01),之后逐渐下降;DF-1细胞分别感染IBDV弱毒疫苗株与分离株后,其chTLR3mRNA表达量均出现先上升后下降的趋势,但其表达量低于标准株(P0.01)。采用间接免疫荧光法检测的chTLR3蛋白的表达变化规律与其基因的表达变化规律相同。结果证实,chTLR3参与IBDV感染DF-1细胞的过程;IBDV的毒力可影响chTLR3的表达。     

苯噁唑与狄普诺啡合剂对眠乃宁麻醉大鼠催醒剂量的确定

以大鼠为试验动物 ,腹腔内注射二甲苯胺噻嗪与双氢埃托啡合剂 (xylazine DHE)麻醉 3 0min时 ,再以腹腔内注射苯唑与狄普诺啡合剂 (Rx7810 94 M5 0 5 0 ) ,通过序贯法测定Rx7810 94 M5 0 5 0对xylazine DHE麻醉大鼠的催醒半数有效量 (ED50 )值 ,根据ED50 值确定Rx7810 94 M5 0 5 0对大鼠的催醒剂量 ,以此剂量测定大鼠给药后的翻正反射恢复阳性率和痛阈。结果 ,Rx7810 94 M5 0 5 0对xylazine DHE麻醉大鼠的催醒ED50 值为 9.93 5mg/kg ,催醒剂量为 15 .0 0 0mg/kg ,翻正反射恢复阳性率为 94.74% ;Rx7810 94 M5 0 5 0组在 5min与生理盐水组比较差异显著 (P <0 .0 5 ) ,10～ 60min与Rx7810 94、M5 0 5 0和生理盐水组有显著差异 (P <0 .0 5 )。     

沂蒙黑山羊发情周期中输卵管促性腺激素受体基因的表达差异研究

采用RT-PCR方法,以持家基因GAPDH为内参,研究沂蒙黑山羊发情周期中卵泡刺激素受体(FSHR)mRNA和黄体生成素受体(LHR)mRNA在输卵管中的表达差异。结果表明,发情周期中促性腺激素受体mRNA在输卵管中都有表达。漏斗部FSHR mRNA在间情期的表达量最高,发情期表达量最低,且发情期与其他3个时期差异极显著(P<0.01)。壶腹部在间情期的表达量最高,发情前期表达量最低,间情期与其他时期差异极显著(P<0.01)。在峡部则是发情后期表达量最高,发情前期最低,发情前期与其他3个时期差异极显著(P<0.01)。LHR mRNA表达量与FSHR mRNA呈相反规律,以发情期漏斗部相对表达量最高,与其他部位差异极显著(P<0.01)。研究结果显示,发情周期中促性腺激素受体基因在输卵管中呈规律性的动态变化。表明,在动物排卵、受精及早期胚胎发育过程中促性腺激素受体mRNA起着一定的调节作用。     

隆朋对大鼠不同脑区GABA及Gly含量的影响

为研究隆朋麻醉下大鼠不同脑区抑制性氨基酸类神经递质含量的变化,探讨隆朋中枢麻醉作用机制,将48只Wistar大鼠随机分成6组,分别为对照组、诱导组、麻醉组、恢复Ⅰ组、恢复Ⅱ组和恢复Ⅲ组。采用反向高效液相色谱法测定各脑区GABA和Gly的含量。结果显示,腹腔注射40mg/kg隆朋后,诱导组大鼠脑干、丘脑、大脑皮质内GABA和Gly的含量与对照组差异显著(P<0.05);麻醉组大鼠脑干、丘脑、大脑皮质内GABA的含量显著升高(P<0.01),脑干、丘脑内Gly的含量显著升高(P<0.01),而大脑皮质内Gly的含量显著降低(P<0.01);恢复Ⅱ组大鼠脑干、丘脑、大脑皮质内GABA和Gly的含量与对照组差异显著(P<0.05);恢复Ⅲ组上述各脑区GABA和Gly的含量均恢复显著(P<0.05);麻醉全程海马、小脑内GABA和Gly含量均无显著变化(P>0.05)。结果表明,隆朋对脑干、丘脑、大脑皮质GABA和Gly含量的影响,可能是其产生全麻作用的重要机制之一;隆朋的中枢麻醉作用,可能与升高大鼠脑干、丘脑、大脑皮质内GABA的含量和脑干、丘脑内Gly的含量,降低大脑皮质内Gly的含量有关。     

高原甘加藏羊发情周期GnRHR基因在垂体和卵巢表达规律的研究

探究高原甘加藏羊发情周期促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因在垂体和卵巢组织中的表达规律,选取处于繁殖期健康未孕高原甘加藏羊48只,分为4组,每组12只,分别于发情前期、发情期、发情后期、间情期从甘加藏羊垂体和卵巢组织中提取总RNA,应用荧光定量RT-PCR方法,以GAPDH为内参,研究高原甘加藏羊发情周期垂体和卵巢组织中GnRHR基因表达的差异。结果显示:高原甘加藏羊整个发情周期不同阶段GnRHR mRNA在垂体和卵巢组织中均有表达。在甘加藏羊发情前期、发情期、发情后期、间情期垂体组织中GnRHR mRNA的相对表达量依次为0.8246±0.1739、1.5100±0.4187、0.2923±0.0202、1.0000±0.2100,其中发情期的相对表达量最高,与发情后期差异极显著(P0.01),与发情前期、间情期差异显著(P0.05);在卵巢组织中,GnRHR mRNA的相对表达量分别为1.0910±0.7665、0.5420±0.0763、1.3799±0.7452、1.0000±1.1221,其中发情后期的相对表达量最高,与发情期差异极显著(P0.01),与发情前期、间情期差异显著(P0.05)。这一研究结果为在分子水平上研究藏羊生殖活动调控机理提供了科学数据。     

小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中。对经鉴定的重组质粒pMD-Ghrelin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达。采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平。结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P0.05或0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P0.05)。qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc(P0.05)、E2F1、CDK2(P0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P0.05)。以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡。     

REV感染对SPF雏鸡胸腺细胞增殖和细胞周期及周期素D1的影响

为了探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染SPF雏鸡后,对其胸腺细胞增殖、细胞周期分布以及Cyclin D1的影响,将66只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,使用Cell counting Kit-8、流式细胞术、Western-blot、荧光定量PCR等方法对雏鸡胸腺细胞增殖、细胞周期及Cyclin D1 mRNA和蛋白的动态变化进行检测。结果发现,REV感染SPF雏鸡后,其胸腺细胞的增殖能力于第14、21、28天明显低于对照雏鸡;G0/G1期细胞数于第14天较对照雏鸡明显(P0.05)升高,S、G2/M期细胞数量减少,第28天时相反;Cyclin D1 mRNA表达于第14天极显著(P0.01)低于对照雏鸡,第35天时极显著高于(P0.01)对照雏鸡;Cyclin D1蛋白量显著(P0.05)或极显著(P0.01)低于对照雏鸡。结果表明,感染REV后,雏鸡免疫机能下降可能与胸腺细胞增殖能力下降、细胞周期素D1 mRNA转录及蛋白质水平的异常表达相关。     

雌激素受体在间情期绵羊输卵管上皮细胞中的表达

为探讨膜性雌激素受体GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1)及雌激素核受体ERα、ERβ在绵羊输卵管上皮细胞中的表达和定位,探讨三种受体在间情期绵羊输卵管中的表达规律,通过RT-qPCR方法和免疫印迹方法分别检测了三种受体基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组化法对输卵管组织中三种受体基因进行定位并对结果进行光密度值分析。结果,输卵管上皮细胞中GPER相对表达量高于ERα、ERβ(P0.01),ERα的相对表达量高于ERβ(P0.05)。免疫组化结果显示,GPER广泛分布于绵羊输卵管上皮细胞中,主要定位于细胞膜及细胞质。而ERα及ERβ主要分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核。阳性细胞光密度分析结果与荧光定量RT-qPCR的分析结果相一致。上述结果表明,间情期绵羊输卵管上皮细胞中同时存在GPER、ERα、ERβ三种雌激素受体表达,且GPER的平均光密度、mRNA相对表达量最高,ERβ的平均光密度、mRNA相对表达量最低。     

孕前染砷对胎鼠睾丸前精原细胞发育潜能的影响

为了探究母代大鼠孕前染砷(As_2O_3)对胎鼠睾丸前精原细胞的毒性作用及生殖发育潜能,将24只雌性SD大鼠随机分为3组(n=8),通过灌胃方式建立As_2O_3染毒模型后,按"一代一窝"繁殖试验技术获得后代。大鼠妊娠第17.5天时取材,碱性磷酸酶染色法鉴定睾丸前精原细胞,透射电镜技术观察前精原细胞超微结构变化,qRT-PCR检测生殖细胞发育相关基因vasa mRNA表达,从而分析前精原细胞的凋亡情况及发育潜能。试验结果显示,与对照组比较,随着孕前染As_2O_3剂量的增加,胞核染色质进一步凝缩成致密团块;粗面内质网减少,结构损害逐渐加重;线粒体肿胀、破裂增多,线粒体颗粒分布更少,电子密度进一步降低,呈空泡状坏死。试验组睾丸组织中vasa mRNA表达量下降,与对照组比较差异显著(P0.05),vasa mRNA表达量下降程度与孕前染As_2O_3剂量呈一定的负相关。试验表明,雌性SD大鼠孕前所染As_2O_3可通过胎盘屏障进入胎儿血液循环,并穿透前精原细胞的胞膜和线粒体膜,影响线粒体结构发生改变,诱导前精原细胞发生凋亡,vasa mRNA表达量下降,从而引起胚胎生殖毒性,抑制生殖细胞发育。     

纳米氧化锌对奶牛小肠上皮细胞增殖及凋亡的影响

为研究纳米氧化锌(nano-ZnO)对奶牛小肠上皮细胞(BIECs)增殖及凋亡的影响,本实验选取初生犊牛P3代十二指肠上皮细胞为试验对象,向培养基中添加0(对照)、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8μg/mL不同浓度的nano-ZnO培养12 h后,通过倒置显微镜、CCK-8法检测细胞的生长状态和增殖活性;微量法检测LDH漏出量;DAPI荧光染色结合Image J图像测定分析nano-ZnO对BIECs凋亡的影响;实时荧光定量PCR对细胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA的表达进行测定。结果显示,与对照组相比,nano-ZnO低剂量各组(0.2、0.4、0.8μg/m L)细胞生长状态良好,核型正常,增殖活性增加,凋亡率无明显差异(P0.05),LDH漏出量无差异(P0.05);高剂量各组(1.6、3.2、6.4、12.8μg/m L)细胞皱缩变圆,密度减小,细胞核致密浓染、裂解,细胞增殖活性降低(P0.05),凋亡率明显升高(P0.05),LDH漏出量明显增加(P0.05);实验组基因Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2的相对表达量与对照组相比随着nano-ZnO浓度的增加呈现先增加后下降的趋势,Caspase-9的表达量随着nano-ZnO浓度的增加先下降后升高再下降,Bax随着Nano-ZnO浓度的增加而下降(P0.05或P0.01)。结论:nano-ZnO低剂量组对BIECs的增殖有促进作用;高剂量组能够抑制BIECs增殖,促进细胞凋亡。     

Nesfatin-1/NUCB2在犬下丘脑-垂体-卵巢轴相关组织上表达与分布的研究

本试验旨在探究Nesfatin-1在母犬生殖轴上的表达以及NUCB2转录水平的变化规律。试验样本采集自幼犬期(1.5 M)、初情期前(4 M)、初情期(7.5 M)和成年期(24 M)母犬,通过免疫组化法观察Nesfatin-1在犬生殖轴上的分布,通过荧光定量PCR检测不同发育阶段母犬生殖轴上NUCB2 mRNA的变化规律。结果,Nesfatin-1阳性细胞主要分布于下丘脑视上核(SON)、下丘脑外侧区(LHA)、神经垂体、腺垂体、卵巢卵母细胞及间质中;在母犬卵巢和垂体中,NUCB2 mRNA自幼犬期至初情期NUCB2 mRNA转录水平不断上升,在初情期达到最高(P0.01),成年期显著下降(P0.01)。下丘脑中NUCB2 mRNA的转录水平自幼犬期至成年期呈逐渐上升的趋势(P0.01)。上述结果表明,Nesfatin-1在犬的生殖轴器官广泛分布和表达。NUCB2 mRNA水平在初情期最高,提示Nesfatin-1可能调控犬的初情期启动。在生殖器官中卵巢中NUCB2 mRNA水平最高,说明Nesfatin-1可能参与卵巢的发育及其功能。     

沂蒙黑山羊发情周期不同阶段卵巢中FSHR和LHR基因表达规律的研究

选取健康未孕的成年沂蒙黑山羊,按发情周期(间情期、发情前期、发情期、发情后期)宰杀取卵巢,采用实时荧光定量差异显示PCR(real-time qRT-PCR)技术,以GAPDH为持家基因,对处于发情周期不同阶段的沂蒙黑山羊卵巢组织内的卵泡刺激素受体(FSHR)、黄体生成素受体(LHR)基因进行了mRNA水平上的相对定量分析。发现FSHR mRNA、LHR mRNA在黑山羊发情周期的卵巢中都有表达。FSHRmRNA的相对表达量依次为0.618 7±0.294 42、1.290 2±0.290 24、2.575 9±0.458 80、0.790 8±0.261 93,其中发情期最高,间情期最低,两者差异极显著(P<0.01)。LHR mRNA的相对表达量依次为2.284 0±0.146 22、0.508 9±0.0789 9、0.340 3±0.045 38、2.859 2±0.205 66,其中发情后期相对表达量最高,发情期最低,两者差异极显著(P<0.01)。结果表明,FSH、LH在黑山羊的整个发情周期中是相互作用、相互影响的。     

小型猪复合麻醉剂对大鼠不同脑区cAMP信号转导系统的动态影响

将252只SD大鼠随机分为对照组和低、高剂量组(分别腹腔注射生理盐水10 mL/kg及小型猪复合麻醉剂5 mg/kg、7.5 mg/kg),每个剂量组又分为麻醉组、恢复I组和恢复II组等3个亚组.用放射免疫法测定不同脑区的AC活性、cAMP含量和PDE活性.结果显示,低剂量小型猪复合麻醉剂基本上对cAMP信号转导系统无明显的作用,高剂量小型猪复合麻醉剂不仅使大鼠大脑、小脑、海马及丘脑等脑区AC活性、cAMP含量明显升高,而且还使PDE活性显著降低,并在此四部分脑区体现出系统性、高度相关性及剂量依赖性.表明,大鼠大脑皮层、小脑、海马、丘脑等脑区的cAMP信号转导系统可能参与了小型猪复合麻醉剂全麻机理的调控,该制剂的全麻作用与激活此四部分脑区的cAMP信号转导系统相关.     

高铜对雏鸭脾影响的组织病理学观察

选用1日龄天府肉鸭360只,随机分为6组,分别以对照日粮(Cu 8 mg/kg)和高铜日粮(Ⅰ组:Cu100 mg/kg,Ⅱ组:Cu 200 mg/kg,Ⅲ组:Cu 400 mg/kg,Ⅳ组:Cu 600 mg/kg,Ⅴ组:Cu 800 mg/kg)饲喂6周,对高铜引起的雏鸭脾的病理损伤进行了观察.结果显示,Ⅰ、Ⅱ组雏鸭的脾组织学变化与对照组比较差别不明显,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾出现不同程度的淋巴细胞减少,电镜下,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾淋巴细胞线粒体肿大,嵴断裂甚至消失,核染色质积聚于核膜下呈环形或团块状;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾的绝对重量、生长指数显著降低(P＜0.05或P＜0.01);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾淋巴细胞的静止期延长,增殖指数明显下降(P＜0.05或P＜0.01);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾淋巴细胞的凋亡率显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01).证实,日粮铜含量400～800 mg/kg可不同程度地抑制雏鸭脾的发育,导致雏鸭细胞免疫功能和体液免疫功能受损.     

T1DM猕猴肝中CB1R和GR及FAAH的表达

通过研究1型糖尿病(T1DM)猕猴肝内大麻素1型受体(CB1R)、脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和糖皮质激素受体(GR)蛋白和mRNA表达量的变化,探讨内源性大麻素系统对糖尿病猕猴肝的影响。苏木精-伊红染色观察糖尿病猕猴肝的病理变化,均可见肝细胞肿胀伴气球样变,不同程度脂肪变性。油红O染色结果显示,糖尿病猕猴组猕猴肝中脂滴含量显著高于对照组(P0.01)。免疫组织化学结果显示,糖尿病组猕猴肝中CB1R表达量高于对照组(P0.05),而糖尿病组猕猴肝中FAAH、GR表达量均低于对照组(P0.05)。实时荧光定量PCR结果显示,CB1R、GR、FAAH的mRNA的表达量变化与蛋白表达一致,对照组与糖尿病组差异相比有高度统计学意义(P0.01)。结果表明,CB1R、GR、FAAH与T1DM猕猴肝病理损伤密切相关,可为临床上该疾病的监测与治疗提供依据。