不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因的克隆及比较研究

为系统研究维氏气单胞菌外膜蛋白AⅠ(OMPAⅠ),对不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因进行了克隆,获得了1 000 bp左右的目的基因,并对其序列进行了比较分析。结果显示,不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ基因的核苷酸序列均具有OMP_b-brl和OmpA_C-like保守结构域,其核苷酸序列同源性在93.6%以上,说明不同动物源性维氏气单胞菌OMPAⅠ具有一定的保守性。研究结果为维氏气单胞菌疫苗的研制提供了一定的理论依据。     

团头鲂致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定长春市某水产养殖场团头鲂的病原菌,从患病团头鲂体内分离到致病菌JWC086,对其形态和生理生化特性进行了鉴定,并对16S r DNA和管家基因gyr B序列、毒力基因携带情况及耐药性进行了分析。结果显示,该菌为革兰阴性菌,其生理生化特性与维氏气单胞菌基本相同。16S r DNA序列比对结果表明,该菌与维氏气单胞菌(KP716691)的同源性在99%以上。基于16S r DNA与gyr B序列的进化分析显示,该菌与维氏气单胞菌同属一个分支,同源性较高。将分离菌人工感染团头鲂,7 d内团头鲂全部死亡,且临床症状与自然病例相似。通过毒力基因检测发现,能从JWC086扩增出气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)、脂肪酶(lip)及密度感应系统调控基因(Lux S)等7种毒力因子。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考及复方新诺明等药物比较敏感。本研究为团头鲂感染维氏气单胞菌的鉴定及治疗提供了科学依据。     

狐源维氏气单胞菌体内诱导基因的筛选

为了筛选狐源维氏气单胞菌体内诱导基因,本研究将狐源维氏气单胞菌人工感染家兔,并取不同感染时期的血清混合,分别用体外培养的维氏气单胞菌和大肠杆菌BL21全菌、二者菌体裂解物以及热变性裂解物进行吸附,用ELISA进行检测;同时构建狐源维氏气单胞菌基因组的p ET系统重组质粒表达文库。再用经吸附处理的血清对狐源维氏气单胞菌基因组文库进行菌落原位免疫杂交筛选,将筛选的阳性克隆进行测序,并用RT-PCR进一步验证。结果显示,最终获得8个狐源维氏气单胞菌的体内诱导基因,分别为GTP焦磷酸激酶基因、转录调控基因Mar R基因、氢化酶细胞膜亚基基因、外膜受体转运蛋白Ton B基因、Ⅲ型分泌系统asc V基因以及3个保守假想蛋白基因。研究结果为维氏气单胞菌保护性抗原的筛选、分子致病机制及跨物种间传播机制奠定了基础。     

维氏气单胞菌rpoN基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为了研究rpoN基因对维氏气单胞菌致病性的影响,采用同源重组的方法构建该基因缺失株。以该菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增rpoN基因的上、下游同源臂;以上、下游同源臂胶回收产物为模板,P1-1/P2-2为引物进行重叠PCR扩增相应目的片段,从而获得rpoN上下游同源臂连接片段;将获取的连接片段连接pRE112,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取重组质粒pRE112-rpoN,经同源重组和抗生素筛选获得维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN。同时,依然利用重叠PCR将目的基因片段与启动子相连接,而后与质粒p BBR-MCS相连接,最后将重组质粒pBBR-MCS-rpoN转化至缺失株ΔrpoN中,构建互补株C-rpoN。PCR鉴定和测序结果显示,成功构建出维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN和互补株C-rpoN。生物学特性分析试验结果表明rpoN的缺失导致维氏气单胞菌TH0426菌落形态改变、生物被膜形成能力下降、动物致病性减弱,鞭毛断裂,运动性丧失。本研究中成功构建了维氏气单胞菌TH0426株rpoN基因的缺失株ΔrpoN,为进一步研究维氏气单胞菌减毒疫苗和rpoN基因的功能奠定了基础。     

鲫鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

为鉴定长春市某渔场鲫鱼病原菌,从患病鲫鱼脾中分离到病原菌J YX-1,通过生理生化试验,16S rRNA、管家基因及毒力基因扩增,系统发育分析和药敏试验进行鉴定。结果显示,分离菌J YX-1对鲫鱼具有致病性;基于16Sr RNA与4种管家基因构建的系统发育树显示,该菌与维氏气单胞菌同属一个分支,亲缘关系较近,表明J YX-1为维氏气单胞菌;毒力基因检测发现,能从J YX-1扩增出气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、黏附素(Aha)、丝氨酸蛋白酶(ser)、核酸酶(exu)及脂肪酶(lip)6种毒力因子基因。药敏试验结果显示,分离菌J YX-1对克拉霉素、妥布霉素及链霉素等11种药物敏感。本研究结果为鲫鱼感染维氏气单胞菌的鉴定及治疗提供了理论依据。     

维氏气单胞菌TH0426株ndk基因缺失株的构建与生物学特性分析

为研究维氏气单胞菌ndk基因的功能,利用自杀性质粒pRE112通过同源重组的方法缺失ndk基因,然后对野生株和缺失株的生长能力、运动性、生物被膜形成能力及LD50等进行差异分析。经过PCR以及荧光定量PCR表达水平证明ndk基因缺失成功;生物学特性研究显示,缺失株的生长能力和泳动性均下降;生物被膜形成能力与野生株相比差异极显著(P0.001);与野生株相比,LD50升高了5.5倍,且差异极显著(P0.001)。由此可以推测,ndk基因与维氏气单胞菌的毒力及生物被膜形成密切相关。本研究结果为维氏气单胞菌致病机制的研究奠定了基础。     

维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的克隆与生物信息学分析及原核表达

为研究维氏气单胞菌胞外产物HisJ基因的可能相关功能,扩增HisJ基因,并通过同源性比较构建HisJ基因的系统进化树,利用相关软件对HisJ基因编码的蛋白进行生物信息学分析,并对HisJ基因进行原核表达以及表达产物的免疫原性进行检测。结果显示,HisJ基因全长774 bp,编码247个氨基酸,TH0426株HisJ与维氏气单胞菌属同一分支,具有信号肽、跨膜区,属于膜外蛋白,二级结构主要以α螺旋、无规则卷曲为主。经SDS-PAGE分析发现,重组菌可表达出融合性蛋白,并且以10‰的体积接菌、IPTG终浓度为1.0mmol/L诱导8 h表达效果最好。Western-blot分析结果显示,重组HisJ蛋白在大肠杆菌中被成功表达且能被小鼠抗HisJ蛋白血清识别,表明表达的HisJ蛋白具有一定的免疫原性。为进一步对HisJ蛋白的结构功能及与致病性、耐药性关系的研究奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp基因缺失株的构建及其部分生物学特性分析

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的致病机制,在全基因测序的基础上,通过同源重组缺失脂蛋白基因。首先扩增脂蛋白基因的上下游同源臂,通过重叠PCR连接后,凝胶回收DNA片段;连接克隆载体pMD18-T,转化DH5α感受态细胞,测序成功后提取质粒进行双酶切,连入相同酶切的Pre112自杀性质粒;依次转化DH5α-λpir、WM3064感受态细胞,作为供体菌;和受体菌野生株进行同源重组,并筛选鉴定。结果显示,成功缺失了维氏气单胞菌脂蛋白基因。生物学特性分析结果发现,缺失株和野生株的生长速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游动能力减弱,细菌的毒力降低,溶血活性没有明显变化。因此,成功构建了维氏气单胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物学特性,为进一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基础。     

Ⅰa型和Ⅱ型牛源无乳链球菌sip基因的遗传进化分析

为分析8株Ⅰa型和10株Ⅱ型牛源无乳链球菌的sip基因特征和遗传进化关系,采用PCR方法扩增目的基因并克隆入pGEM-T Easy载体后测序,进行了同源性分析和构建了遗传进化树。结果显示,18株菌株的sip基因全长均为1 305bp,无基因缺失。8株Ⅰa型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为99.8%～100%和99.5%～100%;而10株Ⅱ型菌株之间的sip基因核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性均为100%。18株菌株与其他不同来源、不同血清型参考菌株相应序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为97.8%～100%和96.8%～99.8%。sip基因的遗传进化树分析显示18株菌株处于2个不同的大分支上,其中Ⅱ型菌株处于同一分支上,与中国菌株Mf32和美国菌株GB01068、GB01089的亲缘关系最近,而Ⅰa型菌株处于另一个分支上,与中国菌株Ly2和美国菌株GB00549的亲缘关系最近。说明8株Ⅰa型菌株和10株Ⅱ型菌株分别来源于不同的菌株,但它们的sip基因同源性很高,而且与参考菌株的sip基因相比,目前仍属于保守基因。     

嗜水气单胞菌Lamp检测方法的建立及应用

基于嗜水气单胞菌气溶素(aerolysin)基因的序列,设计了1套引物,通过条件优化,成功建立了针对致病性嗜水气单胞菌的环媒恒温基因扩增(Lamp)检测法。采用Lamp法对病原菌进行了扩增,并对病鱼血样进行了检测。结果表明,该法只检出致病性嗜水气单胞菌。对不同浓度的细菌悬液扩增结果表明,Lamp检测嗜水气单胞菌的最低菌液浓度为1.4~14/μL。     

猪源嗜麦芽窄食单胞菌16 S rRNA基因的克隆和序列分析

从临床病猪无菌采集抗凝血 ,抽提全血基因组DNA ,用能够扩增大多数真细菌 16SrRNA基因的通用引物 ,扩增出长度为 15 0 2bp的嗜麦芽窄食单胞菌的 16SrRNA基因 ;该基因与国外报道的嗜麦芽窄食单胞菌部分临床和环境分离株核苷酸序列的同源性达 99%以上。证实嗜麦芽窄食单胞菌可感染猪。     

iss基因与鸡大肠杆菌致病力的关系

为探讨iss基因的存在及其核苷酸序列的差异与鸡大肠杆菌致病力的关系,分别采用普通PCR及套式PCR方法检测iss基因在21株鸡大肠杆菌菌株中的分布,并进行序列测定,分析菌株携带iss基因的情况及不同毒力的菌株间iss基因序列的差异。结果显示,经套式PCR检测21株鸡大肠杆菌均携带iss基因,而普通PCR检测显示仅有13株携带iss基因;16株菌株iss基因与国外禽大肠杆菌iss基因参考序列同源性为100%;其余5株中,E1与参考序列同源性为93.5%,E33、O78与参考序列同源性为99.4%,E4、E21与参考序列同源性为99.7%。推测,iss基因可能在不同来源、不同毒力、不同血清型的鸡大肠杆菌中都普遍存在,仅是拷贝数高低不同,而不是目前普遍认为的"有或无"的关系,并且iss基因序列是高度保守的。iss基因与鸡大肠杆菌致病力的相关性可能与它所定位的质粒拷贝数有关,与iss基因的序列差异无关。     

维氏气单胞菌胞外产物免疫反应蛋白的筛选

为筛选维氏气单胞菌胞外产物的免疫反应蛋白,提取维氏气单胞菌TH 0426株胞外产物,利用双向电泳技术对其进行分离,比对蛋白胶与免疫印迹膜上的蛋白反应点,进行质谱鉴定。结果显示,应用免疫蛋白质组学方法筛选维氏气单胞菌胞外产物免疫反应蛋白,共得到24个免疫反应蛋白点,成功鉴定18个,经分析为11种蛋白,分别是肽酶S8、长链脂肪酸转运蛋白、溶血素样毒素、膜蛋白、主要外膜蛋白O mp AⅠ、麦芽糖、ABC底物结合转运蛋白和几种假定蛋白。本研究结果为维氏气单胞菌疫苗的研制奠定了基础。     

维氏气单胞菌毒力因子的研究进展

为给维氏气单胞菌致病机制及疫苗深入研究奠定基础,综述了近年来国内外对维氏气单胞菌毒力因子研究的进展,包括外毒素、胞外蛋白酶、黏附因子以及分泌系统。     

牦牛PGF基因特征的分析及其在不同来源囊胚中表达情况的检测

为了探讨牦牛(Bos grunniens)胎盘生长因子(PGF)的特征及其在不同来源囊胚中的表达差异,依据黄牛(Bos taurus)PGF基因序列5′端和3′端的保守序列设计特异性引物,RT-PCR克隆得到牦牛PGF基因,利用生物信息学软件对牦牛PGF基因进行特征进行预测分析,同时采取实时荧光定量(RT-qPCR)检测PGF基因在牦牛体外受精囊胚和体内来源囊胚中表达的差异性。结果,本研究成功克隆得到牦牛PGF基因序列(GeneBank登录号:KU902418),在组成蛋白质的149个氨基酸中,含量最高的是半胱氨酸Cys(27.9%),最低的是丙氨酸Ala(21.4%),PGF基因编码的蛋白为亲水性蛋白。同源性分析和系统进化树分析结果表明,牦牛PGF基因与黄牛PGF基因具有高度同源性,为99.3%,表明PGF基因在进化过程中有高度的保守性。实时荧光定量结果显示,体内来源囊胚的PGF基因表达水平显著高于体外囊胚(P0.05),约为体外囊胚的6.3倍。结果表明,PGF基因体外囊胚低水平表达在一定程度上影响囊胚附植。上述研究结果为哺乳动物囊胚附植机制研究提供了一定的理论基础。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

维氏气单胞菌OmpAⅠ基因重组植物乳杆菌的构建及其表达产物的免疫原性分析

为构建维氏气单胞菌OmpAⅠ基因重组植物乳杆菌并检测其表达产物的免疫原性,将目的基因克隆至大肠杆菌-乳杆菌穿梭表达载体p SIP409中,并电转至植物乳杆菌中,经诱导后对表达产物进行Western-blot分析。结果显示,LP/p SIP409-OmpAⅠ重组植物乳杆菌出现一条约42 ku的印迹,与预期大小相符,表明重组蛋白具有反应原性。LP/p SIP409-OmpAⅠ重组植物乳杆菌免疫鲫鱼后,在第25天血清中Ig M水平达到高峰;RT-PCR检测发现免疫后鲫鱼肝、脾、肾及心组织中的细胞因子IL-8、IFN-γ与IL-1β表达水平均有不同程度提升;攻毒后LP/p SIP409-OmpAⅠ免疫组的保护率在65%以上,高于对照组的存活率。结果表明,应用重组植物乳杆菌LP/p SIP409-OmpAⅠ免疫鲫鱼能刺激机体产生免疫应答反应,为预防鱼类维氏气单胞菌感染的重组植物乳杆菌口服制剂的研发奠定了基础。     

狐源豚鼠气单胞菌的分离鉴定

2015年辽宁鞍山某狐狸养殖场偶发病原菌感染。病死狐狸后肢肌肉液化,出现溃疡。为查明致死原因进行了实验室诊断,从病灶部位分离到1株优势菌株,命名为M12。综合细菌形态观察、生理特性研究、传统生化试验和VETEK 2全自动生化分析,结果显示,该株菌为豚鼠气单胞菌,革兰阴性短杆状,最适生长温度30℃,最佳p H 7~8,细菌生长曲线比较显示,M12在相同条件下增殖速度明显高于豚鼠气单胞菌模式菌株。通过测定M12的16S r RNA和管家基因gyr B进行了气单胞菌属种内分子水平鉴定,BLAST结果显示,16S r RNA和gyr B基因与Gen Bank上的豚鼠气单胞菌同源性达到100%。将16S r RNA测序结果提交到Gen Bank,获得登录号KX170836。M12含有细胞毒性肠毒素(cytotoxic enterotoxin,act)和热敏感细胞肠毒素(heat-Labie cytotonic enterotoxin,alt)两种毒力基因。小鼠感染试验得到M12的LD_(50)为8×10~8,具有很强的致病性。药敏试验结果显示,该菌对大部分的抗生素具有很强的敏感性,从而为该菌的防治提供依据。     

北京鸭Ⅱ型干扰素基因分子克隆与序列分析

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激培养的北京鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增得到北京鸭Ⅱ型干扰素(1FN-γ)基因(DuIFN-γ2).序列分析表明,DuIFN-γ2基因长度与报道的鸭IFN-γ基因(AF087134)长度一致,为497个核苷酸,共编码145个氨基酸的成熟蛋白,推测其分子量约17 ku.两者核苷酸水平的同源性为99.6%,有2个位置发生非同义变异,其氨基酸序列的同源性为98.6%;与其他禽类的同源性为67.0%-68.0%,与人的同源性为34.4%.