Ⅰ型鸭肝炎病毒间接免疫酶染色检测方法的建立

以蔗糖密度梯度离心提纯的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)免疫兔制备兔抗DHV-Ⅰ抗体,建立了检测石蜡组织切片中DHV-Ⅰ抗原的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidase staining,IIS)方法,并对DHV-Ⅰ强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明,IIS与DHV-Ⅰ感染死亡或濒死雏鸭的肝等呈现阳性反应,与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝以及健康雏鸭的肝呈现阴性反应。感染DHV-Ⅰ死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性,DHV-Ⅰ抗原主要分布于感染细胞的细胞质。该IIS法具有良好的特异性,可用于DHV-Ⅰ在感染雏鸭组织细胞中的亚细胞定位、DHV-Ⅰ感染雏鸭的实验室诊断、甲醛固定组织的回顾性诊断。     

番鸭呼肠孤病毒乳胶凝集试验检测方法的建立

建立了用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒(DRV)抗体致敏乳胶检测DRV抗原的方法。通过试验,确定抗体致敏乳胶的最佳浓度为1∶10(IgG蛋白浓度为0.424 2 mg/mL),最佳致敏温度为37℃,最佳致敏时间为120 min。用所建立的方法对人工感染的1 日龄雏番鸭30 只进行粪便检测,结果表明,感染后第3 d粪便中即可检测到病毒,直至人工感染鸭全部死亡都可从粪便中检出病毒抗原;对同样人工感染的30只1日龄雏番鸭的心、肝、脾病料用所建立的方法检测,结果表明,感染后第4 d,2/3番鸭脾病料检出阳性;感染后第5 d,2 只死亡鸭中有1 只肝病料检出阳性,脾病料2只都呈阳性;此后的病死鸭脾和肝病料均为阳性,而心则未检出阳性。     

基于VP0蛋白的用以检测1型鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA的建立和应用

为检测1型鸭甲肝病毒(DHAV1)抗体,在大肠杆菌中表达获得了DHAV1的重组VP0蛋白,以纯化复性的重组VP0蛋白为抗原建立检测DHAV1抗体的间接ELISA(VP0-ELISA)。其最佳反应条件为:以1.67μg/mL重组VP0蛋白37℃孵育1h后4℃包被过夜;50g/L明胶封闭0.5h;被检血清1∶160稀释,37℃孵育1h;HRP标记的山羊抗鸭IgG进行1∶400稀释,37℃孵育1h;TMB避光显色10min,测定D450nm/D630nm值,阳性阈值为0.375。该方法具有较强的灵敏性、特异性和重复性。用建立的间接VP0-ELISA对60份鸭血清样本进行检测,与以DHAV1作为包被抗原的ELISA相比,阳性检出率为92.3%,阳性符合率为90.0%。上述结果表明,基于VP0蛋白的间接ELISA可用于临床DHAV1抗体的检测和流行病学调查。     

H5N1禽流感病毒感染雏鸭免疫器官TGF-β1 mRNA转录及病理损伤的变化

为了探索鹅源H5N1禽流感病毒(AIV)感染对雏鸭胸腺、脾脏、法氏囊的病理损伤及对TGF-β1mRNA转录的影响,将120只21日龄雏鸭随机分为AIV感染组(I)和对照组(C),应用RT-PCR和免疫组织化学技术结合病理学检测方法,对上述免疫器官的细胞凋亡数量、病理形态变化以及TGF-β1 mRNA转录进行了系统研究。结果显示,雏鸭感染AIV后第3～5天,免疫器官的病理损伤最为明显,脾脏、胸腺和法氏囊细胞凋亡数量分别在病毒感染后第1～5天、第3～5天显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于对照雏鸭。TGF-β1 mRNA转录均在病毒感染后第1～5天较对照雏鸭明显(P0.05)升高。上述研究结果表明,鹅源H5N1亚型AIV感染雏鸭后的初期,不但免疫器官第的淋巴细胞凋亡明显,而且TGF-β1 mRNA转录也明显升高;鹅源H5N1亚型AIV既是引起感染雏鸭免疫功能下降、呈现免疫抑制的主要因素,也是导致病毒感染雏鸭死亡的主要原因之一。     

蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用将纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单抗的杂交瘤细胞株.用纯化的BTV免疫家兔,按常规方法制备BTV多抗.选用抗VP7单抗(1F5)包被ELISA板,用兔抗BTV多抗作为捕获抗体,建立了BTV双抗体夹心ELISA检测方法.用该ELISA方法分别检测BTV、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、小反刍兽疫病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性.用该ELISA和RT-PCR同时检测259份临床样品,ELISA的特异性和敏感性分别为99.1%和85.7%,两种方法的符合率为97.7%.该方法的建立为BTV的检测及蓝舌病的流行病学调查提供了有效工具.     

黑龙江省鸭肝炎病毒HD-Ⅰ株的分离与鉴定

从黑龙江省某鸭场疑似鸭病毒性肝炎 (DVH )的发病雏鸭肝等组织中分离到 1株病毒HD Ⅰ株。经病理学检查、电镜观察、鸭胚中和试验、雏鸭保护试验、动物回归试验等鉴定为血清Ⅰ型鸭肝炎病毒 (DHV)。证实引起该鸭场雏鸭发病和死亡的主要原因为DVH所致。用DHV标准R85 95 2毒株多次强化免疫健康鸡 ,获得高效价的鸡抗鸭肝炎超免疫抗体。     

应用间接免疫荧光法检测新型鸭瘟病毒

采用人工方法给雏鸭和成鸭攻击新型鸭瘟病毒 (NDPV) ,攻毒后于不同时间采样 ,对不同脏器进行间接免疫荧光法检测 ,确定了最佳采样检测时间和病毒在多种脏器内的定位 ,并对其致病力、致病时间、交叉检测结果等与鸭瘟病毒 (DPV)进行了对比。结果表明 ,NDPV对雏鸭致病力较强 ,病毒含量以肝、脾最高 ,其次为血液、脑、鼻腔分泌物 ;NDPV和DPV与它们的对应超免疫血清之间有交叉反应 ,但阳性较弱 ;冰冻切片制成的抗原片阳性检出率明显高于压印片     

雏鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后主要组织器官超微病理变化及病毒抗原分布的动态变化研究

应用电子显微镜技术和RT-PCR检测方法,对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)感染雏鸭后的主要组织器官超微结构变化和病毒抗原分布的动态变化进行了研究,为进一步探讨H5N1亚型AIV的致病机制提供了十分重要的参考依据。21日龄雏鸭感染AIV后第3~7天,RT-PCR结果显示,雏鸭各个实质器官内均有AIV分布,但不同组织无论病毒出现时间,还是病毒的持续时间,均有较大差异,其中肝脏和胰脏,检出病毒时间最短,持续时间最长;组织显微病理学结果显示法氏囊、脾脏和胸腺等免疫器官内淋巴细胞数量减少,部分细胞核固缩、染色质边集或溶解;肺泡上皮细胞部分细胞核固缩变形等。上述研究结果表明,H5N1亚型AIV感染雏鸭后具有广泛的组织细胞嗜性,其中,肝脏和胰脏是该株AIV复制的主要靶器官,AIV诱导呼吸器官和免疫器官发生明显的细胞坏死或凋亡可能是H5N1亚型AIV致病性的重要表现形式。     

新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定

从北京和广西发病鸭群中分离到 2株病毒 ,分别编号为B株和G株 ,病毒大小约 40nm ,无囊膜。血清中和试验表明 ,2株病毒为同一血清型 ,与 1、3型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒无血清学相关性。人工感染试验表明 ,G株对雏鸭具有很强的致病性 ,可引起典型的鸭肝炎病变 ,但死亡率随雏鸭日龄的增长而明显下降 ;B株病毒不能致死正常雏鸭 ,但雏鸭经过环磷酰胺处理后 ,感染B株病毒可引起雏鸭死亡 ,死亡鸭肝肿胀、出血     

鹅细小病毒和鸭瘟病毒复合PCR检测方法的建立

根据GenBank中的鹅细小病毒(GPV)和鸭瘟病毒(DPV)基因序列,分别设计合成了针对GPVVP3和DPV UL6基因片段的2对引物,以GPV-GZ1株鹅胚尿囊液和DPV-SD株鸭胚尿囊液的核酸提取物混合液作为模板,经优化反应条件,成功建立了检测GPV和DPV 2种病毒的复合PCR方法.特异性试验结果显示,该方法对GPV-GZ2株与DPV-SC株病毒核酸的扩增均获得550 bp和376 bp的2条特异性目的片段,而对鹅副黏病毒、鸭肝炎病毒、鸭源沙门菌、鸭源巴氏杆菌和鸭疫里默氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为1.66 Pg,对DPV核酸为0.166 Pg;对人工感染雏鹅的肝组织进行PCR扩增,结果可检测到相应的特异性病毒核酸片段.表明,建立的复合PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和DPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断.     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

鸭疫里氏杆菌平板凝集抗原的制备

为了对鸭传染性浆膜炎进行快速的型别诊断,探索了不同灭活方法、菌液浓度、染色方法和保存条件对标准1型和2型鸭疫里氏杆菌凝集抗原的影响。结果显示,用甲醛溶液灭活细菌制备的抗原比加热灭活的灵敏度高;石炭酸复红染色液的染色效果优于虎红染色液和草酸铵结晶紫染色液;经石炭酸复红染色液染色的菌液浓度达到109数量级时,常温和4℃保存1年稳定性良好。结果表明,制备的鸭疫里氏杆菌平板凝集抗原可用于临床鸭疫里氏杆菌感染或免疫后抗体的检测。     

水貂肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以抗水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)单克隆抗体为捕获抗体、兔抗MEV多克隆抗体为检测抗体,建立了MEV双抗体夹心ELISA检测方法。该方法用于MEV抗原的检测。经过试验,单克隆抗体的最适稀释度为1∶20,兔抗MEV多克隆抗体的最适稀释度为1∶3 200。用该ELISA方法分别检测MEV、水貂阿留申病病毒、犬瘟热病毒样品。结果表明,ELISA方法具有良好的特异性。用该ELISA和PCR同时检测158份临床样品,其中ELISA检测40份为阳性,PCR检测44份为阳性,该ELISA的特异性和敏感性分别为95.6%和79.5%,这2种方法的符合率为91.1%。该方法的建立为MEV的检测及水貂病毒性肠炎的流行病学调查提供了工具。     

胸膜肺炎放线杆菌抗体ApxⅣ-Dot-PPA-ELISA检测方法的建立

本研究构建了胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素ⅣA(ApxⅣA)的原核表达质粒pET-28a(+)-ApxⅣ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为48ku的ApxⅣ蛋白,经Western-blot分析表明该重组ApxⅣ蛋白具有反应原性。试验进一步用纯化的重组ApxⅣ蛋白作为抗原,建立了胸膜肺炎放线杆菌抗体的Dot-PPA-ELISA检测方法,该方法诊断膜片上点样ApxⅣ抗原质量为0.737μg,该方法检测灵敏度高,可检测到胸膜肺炎放线杆菌标准阳性血清IgG的最低含量为8.374×10-9 g;检测特异性好,不与副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪链球菌2型、多杀性巴氏杆菌、日本脑炎病毒的阳性血清发生交叉反应。应用建立的诊断方法对446份临床血清样品进行检测,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性检出率为25.37%。结果表明,该方法具有操作方便、灵敏、结果易于判读等优点,可应用于猪场猪传染性胸膜肺炎的血清学诊断。     

牛传染性鼻气管炎抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测

将无血清细胞培养的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗原包被于硝酸纤维素膜,加入待检血清样品后,利用纳米胶体金标记的山羊抗牛IgG显色,建立了检测IBR抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测试纸盒。整个试验过程仅需5min即可判断结果,与蓝舌病、牛赤羽病、牛地方流行性白血病、牛病毒性腹泻黏膜病、猪瘟、猪伪狂犬病和猪细小病毒病的阳性血清不发生交叉反应。将该法与用于IBR抗体检测的ELISA方法同时对300份临床牛血清样品进行IBR抗体检测,结果二者的阳性符合率达94.4%。结果表明,该法具有特异、敏感、快速可靠、效果直观、结果容易判断的特点,非常适用于IBR的早期诊断和流行病学调查。     

斑点免疫金染色检测雏鹅新型病毒性肠炎抗体研究

应用提纯的雏鹅病毒性肠炎病毒（ＮＧＶＥＶ）抗原制备抗原诊断膜，建立了ＩｇＧ的金颗粒标记、抗原抗体反应同步试验的斑点免疫金染色（ＤｏｔＩＧＳ）检测雏鹅新型病毒性肠炎（ＮＧＶＥ，暂定）抗体的方法，只需３０～４０ｍｉｎ即可判断结果；与本动物抗ＧＰＶ，ＤＰＶ，ＮＤＶ，ＩＢＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ，ＩＢＤＶ，ＥＤＳＶ及多杀性巴氏杆菌血清不发生交叉反应；对兔抗ＮＧＶＥＶ的ＩｇＧ的最低检出量为１．０×１０－１０ｇ／ｍＬ。雏鹅感染ＮＧＶＥＶ强毒后第３ｄ、成年鹅接种ＮＧＶＥＶＣＮ４０弱毒疫苗后第３ｄ即可检测到相应抗体。对重庆市和四川省１０个县（市）的６１７份成年鹅血清进行检测，结果ＮＧＶＥ的血清阳性率为３０．４４％～３６．８４％。该法适用于雏鹅感染的早期诊断、成年鹅的血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价等。     

鸭疫里默氏杆菌与鸭源呼肠孤病毒混合感染的病理学诊断

为确诊湖北省某鸭场自然发病的13日龄雏蛋鸭的死亡原因,对送检的7只病鸭进行了临床症状观察、病理剖检、细菌分离鉴定、病毒PCR/RT-PCR检测和组织病理学分析。结果显示,病鸭临床症状为头肿大流泪,脚软,共济失调,排白色稀便。病理剖检观察到病鸭有严重的全身浆膜纤维素性渗出和脾坏死,法氏囊、胸腺萎缩;分离细菌的培养鉴定结果为革兰阴性短杆菌,16S rRNA测序结果鉴定该分离菌株为鸭疫里默氏杆菌,药敏试验得出该分离菌对头孢类和阿莫西林等敏感;通过病毒特异性引物扩增出鸭呼肠孤病毒条带;组织病理学观察见纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎,脾坏死,胸腺和法氏囊淋巴细胞减少。综合以上研究结果,表明该批鸭是由鸭疫里默氏杆菌与鸭源呼肠孤病毒混合感染而导致大量发病死亡的。     

应用单克隆抗体探针检测牛白血病病毒抗原

应用抗牛白血病病毒(BLV)糖蛋白(gp~(64))抗原单克隆抗体(MAB)探针(Probes),分别检测了培养细胞、生物制品及感染牛羊组织内BLV抗原。结果:FLK/BLV细胞系中BLV抗原生成规律为,培养1～4天时,细胞系中BLV抗原分泌量依日递增,5～7天时,抗原生成量趋于平衡;通过对3批琼脂免疫扩散(AGID)诊断抗原的检测可进行质量评价;实验感染BLV传代绵羊淋巴细胞内BLV-gp抗原全部阳性;我国江南某奶牛场200头奶牛淋巴细胞样品中,75头样品BLV抗原阳性。检出率37.5％。AGID法检出BLV抗体阳性牛56头,检出率为28％。两种技术检测的符合率为88.5％;哈尔滨市郊某奶牛场100头奶牛淋巴细胞样品,抗原抗体检测均为阴性。本方法特异性、敏感性强,为地方流行性牛白血病(BEL)的检测开辟了新途径,建立了新技术。     

检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。     

鹅细小病毒在雏鹅体内分布的免疫组织化学检测

采用间接免疫酶组织化学染色法对14日龄雏鹅人工感染鹅细小病毒后不同时间段病毒抗原在体内的定位及分布情况进行了检测,同时应用图像分析软件对免疫组织化学图像中的抗原强度进行了定量分析。结果显示,感染后第1天到第21天,在心、肺、脾、肝、法氏囊、胸腺、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、食管12种组织器官中检测到了病毒抗原。其中感染后第5天的感染组织最广泛,抗原染色强度最高,在检测的组织中以空肠的检出率最高。病毒抗原广泛分布于肠道的上皮细胞、腺上皮细胞,肺泡壁细胞和肾小管的上皮细胞内。始终未能从大脑、胰腺和骨骼肌中检测到鹅细小病毒。可见该病毒感染雏鹅后存在于患病鹅的大部分组织器官内,进一步证实该病毒是一种泛嗜性病毒。