传染性法氏囊病病毒vp3基因在昆虫细胞中的表达及其ELISA抗原反应性的分析

为分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP3蛋白的ELISA抗原反应性,将IBDVvp3基因插入杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-vp3并转化大肠杆菌DH10Bac感受态细菌,经抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBac-vp3。用pBac-vp3转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-vp3。对重组杆状病毒感染的Sf9细胞用Western-blot检测,在33ku处存在一条特异的蛋白条带;用间接免疫荧光试验检测时可见特异性荧光。以纯化的重组VP3蛋白为包被抗原建立了检测IBDV抗体的间接ELISA(VP3-ELISA),并与重组VP2蛋白包被抗原建立的VP2-ELISA和全病毒抗原ELISA(IDEXX-ELISA)进行了比较。对42份不同鸡血清中IBDV抗体的检测结果显示,VP3-ELISA的区分度低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA阳性检出率低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数低于VP2-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数。结果表明,在昆虫细胞中表达的重组VP3蛋白具有良好的特异性和抗原反应性,用它建立的ELISA的抗原反应性弱于用重组VP2蛋白和IBDV全病毒抗原建立的ELISA的抗原反应性。     

旋毛形线虫P53重组蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的旋毛形线虫P53排泄分泌(ES)重组蛋白作为包被抗原,建立了检测旋毛形线虫P53 ES蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为2/μg/mL(100 μL),血清稀释度为1∶200,辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体稀释度为1∶10 000,抗原和血清于37℃反应1.5 h,血清和二抗于37℃反应1 h,底物于37℃显色10 min.应用该方法对试验小鼠血清进行检测,结果表明,建立的间接ELISA方法具有较好的特异性和重复性,适用于检测特异性P53血清抗体.     

牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

猪传染性胃肠炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

本试验用2株抗TGEV重组N蛋白的单抗2C2和2G7与抗TGEV重组N蛋白的多抗血清和抗TGEV全病毒的多抗血清通过抗体两两配对,建立了一种双抗体夹心ELISA检测病原的方法。结果表明,2C2单抗作为包被抗体、N蛋白多抗作为检测抗体时能有效检出TGEV病原。对该ELISA方法的反应条件进行优化,确定最佳反应条件如下:2C2单抗稀释度1∶1 000于37℃包被2 h,检测抗体N蛋白多抗稀释度1∶1 000于37℃孵育1 h,夹心抗原细胞毒在37℃孵育2 h,酶标抗体稀释度1∶2 000在37℃反应30 min,底物于室温显色15 min。所建立的检测方法经过特异性、敏感性和重复性等检测,表明该方法特异性良好,能特异地捕获细胞毒TGEV并和PEDV、PRV没有交叉反应,能检出的最低病毒浓度为13.37 g/m L,批内5个样品的变异系数小于5%,批间5个样品的变异系数小于10%,重复性良好,可以用于TGEV病原的快速检测。     

副猪嗜血杆菌不同血清型稳定表达蛋白的筛选及间接ELISA检测方法的建立

为了建立一种能够检测不同血清型副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA,选用了在4、5、12型副猪嗜血杆菌中稳定表达的3种蛋白经原核表达后作为候选抗原和全菌裂解物同时包被酶标板,对临床猪血清进行副猪嗜血杆菌抗体检测,发现以锰依赖的超氧化物歧化酶(MSD)作为包被抗原得到的结果最接近用副猪嗜血杆菌全菌裂解物进行ELISA检测的结果,故确定以MSD蛋白为抗原建立间接ELISA。通过方阵滴定对ELISA反应条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:包被抗原的质量浓度为1.5μg/mL,4℃过夜;50g/L脱脂奶粉溶液37℃封闭2h;血清稀释度1∶160,37℃作用90min;酶标二抗的稀释度为1∶15 000,37℃作用45min;底物显色时间为37℃6min。抗体临界值D450nm≥0.245 1判为阳性,D450nm0.208 3判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒、红斑丹毒丝菌、马链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肠炎沙门菌血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。用建立的间接ELISA对114份临床血清进行检测,与4、5、12型全菌裂解物的ELISA检测结果比较,阳性符合率分别为80.77%、80.00%和90.00%。结果表明,建立的间接ELISA可被用于4、5、12型副猪嗜血杆菌的抗体检测和流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测猪伪狂犬病病毒(PRV)黏膜免疫时特异的IgA抗体的间接ELISA方法,本研究采用PCR方法扩增了PRV gB基因截短片段,并将其连入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建的表达质粒转化至大肠杆菌Transetta(DE3)菌株后,采用IPTG进行诱导表达,得到gB重组蛋白的可溶性表达,并用谷胱甘肽亲和层析柱进行蛋白纯化。以纯化的gB重组蛋白作为包被抗原,以山羊抗猪IgA-HRP为二抗,建立了猪伪狂犬病病毒IgA的间接ELISA检测方法。经ELISA反应条件优化,确定抗原包被浓度为2.4μg/mL,封闭液为10 g/L明胶,一抗37℃孵育1.5 h,二抗1∶20 000稀释后37℃孵育0.5 h,TMB显色液显色10 min。该方法的批内和批间变异系数均小于10%,重复性较好。利用该间接ELISA方法对PRV黏膜免疫的仔猪进行检测,结果可以在鼻腔黏液中检测出特异的IgA抗体。本试验为PRV黏膜免疫提供了初步检测方法。     

牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症间接ELISA诊断方法的建立

根据菌体蛋白可以刺激机体产生相应抗体的原理,建立了以产气荚膜梭菌粗提菌体蛋白为抗原的检测牛D型产气荚膜梭菌抗体的间接ELISA.结果显示,D型产气荚膜梭菌菌体裂解抗原最适包被浓度为50 μg/mL,最适包被条件为37 ℃ 1 h;被检血清的最适稀释度为1∶100,酶标二抗的最适工作浓度为1∶1 000,血清与酶标二抗的反应时间均为37 ℃ 1 h;最适封闭时间为37 ℃ 1 h;PBST稀释液中脱脂乳的浓度为30 g/L;底物最适反应条件为室温25 min;阴阳性临界值为0.032.对采集于吉林省延边州的100份牛血清样品采用建立的间接ELISA进行了检测;结果,阳性率为11.0%.经特异性试验、重复性试验和与琼脂扩散抗体检测法比较,采用裂解菌体蛋白为抗原建立的ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测塞内卡病毒VP2蛋白的间接ELISA方法,本试验将A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了筛选。结果显示,VP2蛋白包被量为2μg/m L(1∶1000稀释);用2%BSA封闭液稀释标准阳性血清为1∶20;二抗做1∶5000稀释;TMB底物显色液室温避光显色反应10 min。特异性试验结果显示,同FMDV、PRRSV、CSFV、PRV和APP阳性血清均无交叉反应。此方法对塞内卡病毒阳性血清的敏感性为1∶160。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本分别进行间接荧光抗体免疫方法和间接ELISA方法的检测,结果符合率为95.5%。上述结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

基于重组IBDV VP3蛋白的免疫磁珠间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

本研究旨在毕赤酵母中表达鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的VP3蛋白,以重组VP3蛋白作为包被抗原建立IBDV血清抗体免疫磁珠间接ELISA检测方法并进行初步应用。利用毕赤酵母表达系统获得约为39 ku的重组VP3蛋白,Western-blotting检测表明,重组VP3蛋白具有良好的特异性和反应原性。免疫磁珠间接ELISA的最佳反应条件:磁珠和抗原偶联的缓冲液是50 mmol/L MES(p H 8.0),偶联时间为3 h,抗原加入量为95μg,抗原与羧基磁珠最大偶联量为80μg。待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶1 600和1∶4 000,血清孵育时间为30 min,酶标二抗孵育时间为20 min。在该优化条件下,阴性、阳性临界值判定标准为0.134。特异性试验显示,对抗AIV、IBV、MDV、NDV阳性血清检测结果均为阴性。敏感性试验显示,本试验所建立的检测方法敏感性高于商品化IBDV血清抗体检测试剂盒。重复性试验显示,批内和批间重复试验的最大变异系数分别为3.8%和5.9%。稳定性试验结果显示变异系数小于7%。用建立的检测方法和商品化IBDV血清抗体检测试剂盒同时检测50份血清,结果显示两种检测方法的相对敏感性为94.6%,相对特异性为92.3%,符合率为94.0%。本试验建立的检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好、稳定性高特点,为其应用于临床IBDV血清抗体的检测奠定了基础。     

鹿流行性出血病病毒VP7-ELISA抗体

以原核表达的鹿流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)VP7蛋白为包被抗原,用HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗,建立了检测EHDV群特异性抗体的间接ELISA方法(VP7-ELISA).用VP7-ELISA方法检测EHDV阳性血清、其他病毒阳性血清及健康羊血清,结果表明,VP7-ELISA方法具有良好的特异性;用VP7-ELISA和琼脂扩散试验(AGID)检测EHDV阳性血清抗体效价,结果表明,VP7-ELISA的敏感性相当于AGID的8～16倍.用VP7-ELISA和AGID同时检测临床样品188份,VP7-ELISA的特异性和敏感性分别为95.9%和100%,两种方法的符合率为96.3%.表明VP7-ELISA可以代替AGID用于EHDV抗体检测.     

鹅副黏病毒NP蛋白间接ELISA检测方法的建立及免疫鹅抗体水平的检测

以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件:抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。     

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。     

猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA的建立与应用

利用伪狂犬病病毒(PRV)ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为:包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是37℃作用1 h;酶标单抗的稀释度为1∶15 000,作用时间为37℃0.5 h。ELISA结果的判定标准为:血清样品阻断率PI≥28.67%时判为阳性;PI≤18.27%时判为阴性;18.27%PI28.67%时判为可疑。该ELISA能特异性地识别PRV阳性血清,而与PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA的重复性试验表明,批间和批内的变异系数均小于10%。比较试验结果表明,该ELISA的相对敏感性和特异性分别为80.9%和96.4%,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为85.1%。用建立的此ELISA对田间采集的535份猪临床血清样品进行了检测,结果显示,PRV抗体阳性率达61.87%。综上所述,本试验建立的猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA具有特异、简单、快速的优点,为建立标准化的检测试剂盒奠定了基础。     

猪巨细胞病毒gB基因优势抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

扩增了猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因的优势抗原表位区,将构建成功的gB基因优势抗原表位区原核表达重组质粒(pET32a-gB)转化入表达菌Rosetta(DE3)中进行表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA检测方法进行了优化。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.9μg/mL,最佳血清稀释度为1∶160,二抗最佳稀释度为1∶10 000;当样品D450nm≥0.26时判为阳性,当样品D450nm<0.215时判为阴性,介于两者之间时判为可疑。用该间接ELISA方法对138份PCMV阴性血清与240份PCMV阳性血清进行检测的结果显示,它的特异性为97.83%,敏感性为97.9%,变异系数均小于10%。用该ELISA方法和Western-blot对184份临床样品进行检测,结果二者的符合率为92.4%。结果表明,该间接ELISA方法简便快捷,具有良好的特异性、敏感性及重复性,适用于对PCMV抗体的大规模检测。     

猪轮状病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪轮状病毒VP6蛋白作为检测抗原,建立检测猪轮状病毒血清抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被量为6μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶5 000。应用该方法检测阴性血清样本30份,确定的检测临界值为0.143(D490nm≥0.143,则判定为阳性)。特异性试验表明,用建立的间接ELISA对传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病病毒阳性血清进行检测时无交叉反应。重复性试验证实,批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本研究建立的用以检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可应用于猪轮状病毒的病原学检测。     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

丝状霉形体山羊亚种血清抗体间接ELISA检测方法的建立

利用丝状霉形体山羊亚种标准株PG3制备抗原,经纯化后作为包被抗原建立了间接ELISA方法,用于检测丝状霉形体山羊亚种血清抗体。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为1.09μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶64,兔抗羊IgG辣根过氧化物酶结合物的最佳稀释度为1∶40 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h。判定标准为样品D490 nm值与标准阴性血清D490 nm值之比(P/N)≥3为阳性,≤2.5为阴性,介于二者之间的为可疑。重复性和稳定性试验证明,建立的间接ELISA的稳定性和重复性良好,与间接血凝试验相比,其敏感性较高。     

传染性法氏囊病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究首先将VP2基因分3段(部分序列重叠),分别为VP2(1~600)、VP2(376~975)和VP2(751~1350),并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行优化,将优化的3个VP2基因片段分别克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western-blot,结果3个重组VP2蛋白均获得了表达。用纯化的3个重组VP2蛋白rVP2(1~600)、rVP2(376~975)和rVP2(751~1350)分别作为包被抗原,建立了IBDV抗体间接ELISA(rVP2-ELISA)。用rVP2-ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验对96份临床血清样本进行检测,结果显示,3个重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较,相对敏感性分别为97.1%、61.8%、58.8%和100%;相对特异性分别为85.5%、82.3%、83.9%和25.8%;符合率分别为89.6%、75.0%、75.0%和52.08%。本研究为研制IBDV抗体间接ELISA检测试剂盒(以重组VP2蛋白作为包被抗原)奠定了基础。     

猪细小病毒2型VP蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了有效监测猪细小病毒2型(PPV2)的抗体水平,选择PPV2VP蛋白主要亲水区及高抗原指数区进行原核表达。以表达的重组tVP蛋白为包被抗原建立了检测PPV2抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被浓度为0.8μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶20 000,检测的临界值为0.400 5(D450nm≥0.400 5判定为阳性)。特异性试验证明,与猪细小病毒1型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒O型血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。应用此方法对采自江苏省的480份临床血清样本进行了检测,PPV2抗体阳性率为31%。试验结果表明,tVP蛋白能很好地获得表达,以此蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床血清PPV2抗体的检测。