两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病(MD)流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒(MDV)Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析.结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%～100%,与MDV Ⅰ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%～99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致.提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征.     

广西玉林地区MDV强毒YL2002株的分离鉴定

广西玉林地区鸡马立克氏病(MD)疫苗免疫鸡群出现MD疫情,笔者从出现MD疫情的规模化肉鸡养殖场采集抗凝血,分离得到MDV野毒株,鉴定为血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV),命名为YL2002。与15株参考毒株进行比对,meq基因核苷酸同源性分析结果显示,YL2002株与JS201801株MDV同源性最高,为100%;与648A株同源性最低,为98.6%。将分离得到的MDV野毒株回归动物实验,分析其对肉鸡品种黄鸡2号的致病性,该分离株攻毒组发病鸡出现瘫痪症状,并发现心脏、肝肿瘤。病理组织学观察可见各组织出现淋巴细胞增生和浸润。致病性结果显示,YL2002攻毒组发病率和死亡率为100%和69.2%。本试验成功分离得到1株MDV强毒株,为广西玉林地区频发的马立克氏病疫情的防控提供了理论基础,也为我国MDV的毒力演化研究提供了参考。     

马立克病抗性选育对鸡感染马立克病病毒后外周血淋巴细胞病毒载量的影响

为研究马立克病(MD)抗性选育对鸡马立克病病毒(MDV1)感染后外周血淋巴细胞病毒载量的影响,利用MDV1攻毒后第4、7、10、14、21、28和35天共7次采集并分离的全部试验鸡的外周血淋巴细胞为材料,采用real-time FQ-PCR方法对这些材料中meq基因进行绝对定量分析以确定其病毒载量,用来分析比较MDV1在MD抗性鸡与普通鸡以及HVT疫苗免疫鸡与HVT疫苗未免疫鸡体内的增殖情况。结果显示,普通鸡非免疫攻毒组(B组)的MDV1含量于攻毒后第10(P0.05)、14(P0.05)、21(P0.01)、28(P0.05)、35(P0.05)天显著高于MD抗性鸡免疫攻毒组(F组),而其他组间均无显著性差异。结果表明,鸡MD抗性选育结合HVT疫苗接种可显著降低鸡体内的病毒载量,从而降低MDV1感染的危害。     

马立克病毒感染鸡端粒酶活性的研究

对1日龄非免疫鸡分别接种马立克病病毒(MDV)Ⅰ型国际标准强毒GA株、国内标准强毒京1株及Ⅰ型MDV疫苗毒CVI988株后第5d起,用改进的TRAP法和Bandscan软件测定分析、计算感染过程中鸡外周血淋巴细胞(PBMC)的端粒酶活性。结果,自接种MDVⅠ型强毒GA株和京1株后,在鸡尚未出现临床症状和可视病变之前端粒酶就可被检测到,并且随着感染鸡日龄的增加逐渐升高,分别在20～25日龄时其相对活力达到最高值;接种MDVCVI988后,整个试验期端粒酶活性均呈阴性。试验结果表明,MDVCVI988疫苗株具有较可靠的免疫效果,PBMC端粒酶活性与马立克病的发病进程具有一定的相关性。     

鸡马立克氏病病毒HC135分离株的致病性

从辽宁省某鸡场疑似马立克氏病发病鸡外周血淋巴细胞中分离到1株适应鸭胚成纤维细胞生长的马立克氏病病毒(MDV),经蚀斑克隆和细胞传代,成功培育了1株增殖性能稳定的MDV细胞毒株,命名为HC135株;将HC135株第4代细胞培养物分别人工感染非免疫和不同疫苗免疫的SPF鸡,分析其对鸡的致病力,分离毒株攻毒对照组鸡的发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10);HVT疫苗及HVT/SB1双价疫苗对分离毒株的保护指数分别为22.2和40.0。结果表明,该毒株可以突破HVT疫苗和HVT/SB1双价疫苗的免疫保护,具有特超强毒株(vv+MDV)的特点;也证实了我国商品鸡群中存在vv+MDV毒株。同时比较了HC135株与14株参考毒株的Meq基因序列,发现其Meq基因的ORF内没有基因片段的插入或缺失,推导的氨基酸存在点突变,这种突变符合高毒力毒株的变异规律。     

鸡马立克病毒野毒株在鸭胚成纤维细胞上的培育及鉴定

用2006～2007年从现地采集的疑似感染鸡马立克病(MD)鸡羽髓分别接种鸭胚成纤维细胞(DEF),蚀斑克隆纯化后,随机选1个单克隆,再接种DEF增殖,获得9株适应DEF的鸡马立克病病毒(MDV)野毒株,分别命名为ZY、FY、SY、YC、CZ、MS、CGZ、QQHE和DH.应用PCR技术分别扩增这9株MDV的132 bp重复序列(132 bpr),发现这9株132 bpr均为2个拷贝,符合致病型MDV的特点.从分离的9株MDV中选择5株,人工感染7日龄SPF白来航鸡.试验鸡表现精神萎靡,被毛凌乱,个体瘦小;60d后剖杀,大多可见内脏肿瘤;SY、FY、QQHE 3株的MD临床阳性率达100%.     

应用ELISA和AGPT检查MDV感染鸡血清抗体的比较

本试验利用马立克氏病病毒(MDV)感染的全细胞包被酶标板的酶联免疫吸附试验(ELISA),检测人工感染鸡血清中的MDV特异抗体,并比较了ELISA和琼脂凝胶沉淀试验(AGPT)的敏感性。 (一) 材料和方法 1. 毒种:MD毒株Z_4由本实验室分离并保存;京-1株血毒由北京市农科院畜牧兽     

检测马立克氏病血清型特异性单克隆抗体的酶联免疫吸附试验

马立克氏病(MD)是由疱疹病毒科马立克氏病毒(MDV)引起鸡内脏淋巴瘤和外周神经淋巴增生为特征的传染性疾病。根据免疫荧光抗体(IFA)试验;免疫扩散(ID)试验和血清中和(SN)试验等血清学方法,Bullow和Biggs将MDV分为三个不同血清型:血清1型病毒,包括致病性毒抹和它们的减毒弱毒株、血清2型病毒是非致病性MDV毒抹;血清3型病毒,包括所有的火鸡疱疹病毒     

马立克氏病病毒和火鸡疱疹病毒的基因分析

马立克氏病(MD)是鸡的一种高度传染性的淋巴组织增生性疾病,致病因子是疱疹病毒科的马立克氏病病毒(MDV)。根据免疫荧光试验、琼脂凝胶扩散试验、病毒中和试验以及特异的单抗的结合反应性,将MDV分成3个血清型:血清Ⅰ型包括引起高发性内脏、神经肿瘤的古典型MDV     

马立克病病毒Meq单克隆抗体的制备

为研制马立克病病毒RB1B超强毒株致瘤蛋白Meq单克隆抗体,本研究通过聚合酶链式反应(PCR)扩增马立克病病毒(Md5)meq基因5′端第1~507位核苷酸,将其克隆入原核表达载体p Cold-TF,转化到BL21(DE3)感受态中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。用融合蛋白His-Meq169腹腔免疫BALB/c小鼠,利用间接免疫荧光(IFA)和Western-blot检测多抗血清;血清检测阳性后,取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,利用IFA和有限稀释法筛选阳性单克隆杂交瘤细胞株,最后筛选出了4株阳性杂交瘤细胞株,即1C11、3E4、3G10和5H11。将获得的单抗经IFA方法检测强毒株Md5或弱毒株CVI988感染的CEF细胞,结果显示,Meq单抗可特异性识别MDV感染形成的细胞空斑。这为进一步研究Meq的生物学功能奠定了基础。     

表达MDV-gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

将马立克氏病病毒 (MDV ) gB基因插入鸡痘病毒中 ,构建了含有MDV gB基因的重组鸡痘病毒 (rFPV ) ,用rFPV、火鸡疱疹病毒 (HVT)冻干疫苗、rFPV HVT二联疫苗分别免疫 1日龄AA肉用雏鸡 ,8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明 ,3种疫苗均诱导了免疫应答 ,免疫保护率分别为 69%、69%和 85 %。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当 ,二者联用具有免疫协同作用。     

2021—2022年我国鸡马立克病的流行病学调查

为了解我国规模化养殖场中马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）的感染和免疫状态,采用四重TaqMan探针荧光定量PCR对采自我国11个省（自治区、直辖市）的19个养殖企业的94个鸡群的羽毛囊和环境样本进行MDV疫苗毒和野毒检测。结果显示,大部分养殖场存在野毒感染,其中山东地区样本平均阳性率较高为13.6%。不同省市白羽肉鸡、黄羽肉鸡和蛋鸡样本的野毒平均阳性率分别为8.3%、3.9%和7.2%。在不同日龄蛋鸡样本中,1～7、8～14和50～80日龄野毒阳性率较高,分别为12.6%、13.8%和14.3%。此外,单独免疫CVI988疫苗或以火鸡疱疹病毒（HVT）为载体的基因工程重组疫苗（rHVT）以及同时免疫这两种疫苗,均能降低MDV野毒的阳性率,且同时免疫两种疫苗鸡群的野毒阳性率最低。对不同免疫方式下疫苗在羽毛囊中复制情况的检测结果显示,在3～4周龄时,单独免疫CVI988疫苗的平均阳性率为91.4%,单独免疫rHVT疫苗的平均阳性率为58.2%,同时免疫两种疫苗时,CVI988疫苗和rHVT疫苗的平均阳性率分别为51.8%和36.9%,提示鸡场应切实做好马立...     

鸡马立克氏病鸡胚免疫接种的研究

本试验对鸡马立克氏病(MD)的火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗接种鸡胚的安全性和免疫保护等进行了初步的探讨。试验表明:18日龄鸡胚接种HVT疫苗对孵化无不良影响,与1日龄 雏鸡接种HVT疫苗比较,鸡胚免疫后较早产生免疫保护,用MD强毒(BJ—1株)腹腔内接种攻击后,保护率明显提高。     

鸡新城疫马立克病二联苗的研制

疫苗联合同时接种,很早以前就被成功地采用了。美国维兰公司出产的禽病疫苗及荷兰出售的禽病疫苗,为二联苗和五联苗。据此,我们引用荷兰鸡新城疫弱毒克隆株(H.Clone30)和我国现引的火鸡疮疹病毒株(HVT),分别以鸡胚和鸡胚细胞复制后,联合干燥制成二联苗,即鸡新城疫马立克病弱毒冻干二联苗。(一)材料与方法1.毒株:①H.Clone30F_6克隆株,血凝价达1:1280(鸡胚复制);②鸡马立克火鸡疙疹病毒HVT FC126干燥株;③强毒株:F_(48)E_(48);④稀释液:马立克病毒稀释液SPGA加4％血清。2.病毒的增殖与收获:(1)H.C30株:以灭菌盐水将H.C30病毒稀释成10~(-4)接种于9～10日龄的健康鸡胚(CE),每只尿囊腔接种0.2ml,于37℃温箱中继续孵育,每日检查2次。鸡胚接种后72小时以前死亡者弃     

京-1株鸡马立克氏病强毒对BWEL-SPF鸡群的感染试验

用京-1株鸡马立克氏病(MD)强毒感染1～10个家系1日龄的BWEL-SPF鸡,观察比较临床症状和剖检病变及病理切片,以此评估该BWEL-SPF鸡群每个家系鸡对京-1株MD强毒的敏感性.结果,1、5、8、9号家系的BWEL-SPF鸡对京-1株MD强毒最敏感;3、4、6、10号家系次之;2、7号家系敏感性相对较差.     

三株鸡马立克氏病病毒流行毒株基因组重复区的序列测定及分析

对国内3株马立克氏病病毒血清1型(Marek’s disease virus type 1,MDV-1)流行毒株的基因组重复区进行序列测定及分析,并与GenBank中登录的MDV-1参考毒株序列进行比较。结果显示,3株毒株的基因组重复区序列具有较高同源性,在进化上属于一独立分支。3株毒株的长重复区长度约为12kb,预测的开放阅读框(ORF)分别为43、40、43个;短重复区约为12kb,预测的ORF分别为27、25、26个。3株毒株的多个ORF中存在它们特有的共性氨基酸突变,是国内MDV-1流行毒株的特有的遗传性特征。该研究为我国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

鸡马立克氏病肿瘤组织端粒酶活性的测定

用鸡马立克氏病病毒( MDV) 京1 株血毒对2 日龄SPF 鸡攻毒,40 d 后剖杀取部分内脏组织,一部分做病理切片,发现有肿瘤细胞浸润者判定为阳性;另一部分组织利用TRAP ( Telom eric repeat am plification protocol) 法进行端粒酶活性测定。结果发现有肿瘤细胞浸润的肾、肝、脾、神经、卵巢、精巢等组织细胞端粒酶活性非常高,且其阳性率与肿瘤细胞浸润的阳性率吻合。     

传染性法氏囊病病毒Ⅰ型变异株的分离鉴定及其多价弱毒苗免疫试验

先后在江苏、浙江、四川等８省（区）从临床患传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料，分离到３２个野毒株，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定，其中１７株病毒为传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ），应用交叉中和试验，将分离毒株分为５个亚型，用ＩＢＤＶⅠ型标准变异株高免血清作中和试验鉴定，其中５个分离毒株有较高中和价，初步定为ＩＢＤＶⅠ型变异株。将其在鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）上连续传代致弱，与标准Ⅰ型弱毒株联合制成多价弱毒疫苗，免疫试验表明多价弱毒疫苗具有良好的免疫效果，免疫组攻毒１００％保护，对照组攻毒死亡率为９２％     

禽白血病病毒J亚群和网状内皮组织增殖病毒共感染的产蛋种鸡的病理学研究及其疫源追溯

为查明禽白血病病毒J亚群(ALV-J)和网状内皮组织增殖病病毒(REV)共感染临床鸡群的原因,对河北省某鸡场患病的产蛋种鸡进行组织病理学检查、病毒分离和可疑病原的间接免疫荧光检测、PCR和ELISA检测,同时对该鸡群所用疫苗中可疑病毒进行病原分离和PCR鉴定。结果,组织病理学检查发现,发病鸡的肝脏、腺胃、肾脏均出现灶状淋巴细胞增殖;用发病鸡肝脏浸液接种DF1细胞后,分别用特异性单抗进行间接免疫荧光检测发现培养物中ALV-J抗原和REV抗原均呈阳性。用ALV-J特异性引物对病鸡肝组织样品进行PCR检测时部分结果呈阳性,产物大小为924 bp;用REV特异性引物对病鸡肝组织样品进行PCR检测时部分结果也呈阳性,产物大小为438 bp。经PCR检测的17份活毒疫苗DNA中,2份为REV核酸阳性,5份为ALV-J核酸阳性,其中有1份疫苗样品呈双阳性,并且PCR阳性产物的序列分别与从蛋鸡体内分离的病毒毒株相一致。系统进化分析表明,分离的疑似REV毒株与中国其他地方分离的REV毒株的同源性高于与REV HA株的同源性,而本研究中分离的ALV-J毒株与ALV-J原型株HPRS-103的亲缘关系最近。以上结果表明,疫苗污染ALV-J和REV与田间ALV-J与REV的高感染率存在着因果关系。     

免疫鸡群发生马立克病的诊断与病理学研究

采用琼脂扩散试验、PCR和病理组织学观察分别对疑似马立克病(MD)病鸡进行确诊和病理学研究。结果显示,琼脂扩散试验中马立克病病毒(MDV1)抗原呈阳性;PCR扩增出567bp的MDV1特异性片段。病理学观察显示,肝、脾、肾和心程度不等肿大,色泽变淡,形成有大小不等和数量不一的灰白色结节。部分病鸡坐骨神经呈单侧性不规则肿粗,弹性降低或丧失。病鸡实质器官及坐骨神经组织中均出现大量多形态的类似淋巴细胞、成淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞及网状细胞的肿瘤细胞聚集和散在,并可见典型的MD细胞,尤其在血管周围和淋巴管周围。各型肿瘤细胞和MD细胞异型性明显,肿瘤细胞周围实质程度不等的变性、坏死,间质水肿。核仁区嗜银蛋白染色结果显示,肿瘤细胞增生活跃,恶性程度较高。