贵州省禽白血病病毒J亚群感染的血清学检测与PCR鉴定

采用禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对8个鸡场的血清样本进行了检测,并对出现肿瘤病变的病死鸡进行了病理组织学检查;同时采集16份禽白血病病毒J亚群(ALV-J)抗体阳性鸡的血液或肝组织,提取DNA样本进行PCR扩增,并测序分析.结果显示,4个肉种鸡场的ALV-J抗体阳性率平均为16.52 %(3.33%～30.0%),而4个蛋种鸡场的ALV-J抗体阳性率均为0.病理组织学观察可见,在肝、肾、脾组织中出现大量增生的、含嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞.PCR检测发现,有14份样本扩增出ALV-J亚群特异性的病原核酸片段(545 bp),检出率达87.5%,其中在3份肝样本中同时扩增出ALV-A亚群特异性的病原核酸片段(691 bp);而ALV-J抗体阴性鸡、淋巴细胞性白血病和血管瘤型白血病的20份样本均未扩增出545 bp片段.扩增出的545 bp片段与ALV-J亚群毒株HPRS-103和ADOL-HcL的相应核苷酸序列的同源性分别达96.2%～96.8%和95.5%～96.8%.结果证实,贵州省鸡群中确实存在ALV-J亚群感染和骨髓细胞瘤病,且出现A亚群、J亚群混合感染的情况.     

福建地方鸡B亚群禽白血病病毒的分离鉴定

在对福建某地方鸡群进行禽白血病流行病学调查的基础上,对疑似病例进行p27抗原检测,取阳性血清接种DF-1细胞分离病毒。采用PCR及间接免疫荧光试验鉴定其亚群并对其gp85基因进行序列分析。结果显示,分离株FJ15HT0的B亚群特异性PCR检测呈阳性;IFA显示感染该毒株的DF1细胞中可检测到p27抗原,而未检测到J亚群特异性囊膜蛋白的表达;对该毒株gp85序列进行分析,发现与多株ALV-B参考毒株氨基酸序列的同源性为91.6%~98.8%,其中与GX10LS01株同源性最高为98.8%,与A、C、D、E亚群同源性在69.4%~84.2%,与J亚群同源性仅为36%~38%。该研究首次分离并鉴定河田鸡群中ALV-B,为后续的研究奠定了基础。     

马立克病病毒1型LZ1309株的分离鉴定与生物特性分析

从免疫马立克病(MD)HVT和CVI988疫苗的甘肃某规模化鸡场采集MD阳性病鸡抗凝全血,分离淋巴细胞,接种于鸡胚成纤维细胞,分离出1株马立克病病毒(MDV)。病毒蚀斑纯化后经PCR和间接免疫荧光鉴定,该毒株为MDV1型毒株,命名为LZ1309株。PCR扩增并测序致瘤基因meq。核苷酸同源性分析结果显示,与国内分离株LS株的同源性最高(99.9%),与CVI988株的同源性最低(98.8%)。氨基酸序列分析显示,氨基酸突变位点符合国内强毒株的特征。为掌握LZ1309株的致病力,进行了LZ1309株攻毒试验。结果显示,LZ1309株攻毒组鸡的死亡率为13.3%,攻毒组鸡体重显著降低,肝、脾、腺胃乳头和心脏均出现肿瘤结节,胸腺和法氏囊严重萎缩。PCR检测攻毒鸡的器官组织,均能扩增到MDV1型强毒株meq基因的特异性条带。本研究成功分离鉴定出1株MDV强毒株,此结果为研究国内MDV毒力演化、致病机理和疫苗研发奠定了重要基础。     

鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立

本研究针对野毒株与疫苗株的H基因设计特异性引物,通过优化反应体系和反应程序,建立了一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法。检测结果表明,该方法能特异性地检测CDV野毒株,与CDV疫苗株、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒均无交叉反应。其标准曲线的相关系数达0.987。检出敏感性达6.22×101copes/L,比常规PCR检测方法高100倍。应用本方法检测了42份临床疑似CD样品,其中41份为野毒株感染,随机选取15份阳性样本进行H基因克隆测序,通过进化树分析显示它们均属于Asia-Ⅰ型,与疫苗株H基因相比同源性较低,核苷酸的同源性在90.3%~91.3%之间,氨基酸同源性在96.3%~97.2%之间。该方法的建立为临床上CDV的鉴别检测提供了依据。     

屠宰肉鸡禽白血病病毒的检测及病理学观察

为了了解肉鸡的健康状况以便对其进行食品安全的风险评估提供依据,本研究从北京某肉鸡屠宰场采集了300份肝、200份脾和100份腺胃,采用HE染色方法对各组织进行病理学观察,用免疫组织化学方法对肝组织中的禽白血病病毒J亚群(ALV-J)gp85特异性抗原进行检测,采用PCR技术对肝组织中的ALV RNA进行检测。结果显示,组织病理学观察可见肝中髓样细胞团块检出率为43%,淋巴细胞浸润病变占75%;脾见有少量淋巴细胞发生坏死、排空;52%腺胃黏膜坏死脱落,25%腺胃黏膜下有淋巴细胞浸润。免疫组织化学观察到肝样品中的ALV-J gp85抗原阳性率为61.7%,脾中阳性率为66.5%,腺胃样品阳性率为52.6%。PCR检测到ALV-J gp85特异性片段PCR产物阳性率为30.5%。利用Gen Bank比对发现与各株ALV-J的同源性为85%~90%。研究结果表明,该屠宰场肉鸡中存在着较高的ALV-J感染。     

乙型脑炎病毒XJ/08/01株的分离鉴定及PrM/E基因的遗传进化分析

从新疆维吾尔自治区石河子地区某猪场采集了150份猪脑组织样品,利用RT-PCR方法进行流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因扩增,结果有32份组织样品扩增出了430 bp的特异性目的条带.用检测的阳性样品研磨液接种乳鼠进行JEV的分离,经3次乳鼠传代后获得了1株JEV,命名为XJ/08/01.在此基础上,设计引物从接毒乳鼠脑组织样品中扩增JEV的主要抗原基因PrM/E并进行序列分析,结果表明,该分离毒株与JEV疫苗株SA14-14-2的同源性为99.6%,根据基因分型法确定该分离株属于基因Ⅲ型JEV.     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒HB09JY03株的分离鉴定及其全基因组序列分析

利用DF-1细胞系、ELISA群特异性抗原检测以及亚群特异性间接免疫荧光法,从湖北省某鸡场送检的海兰褐蛋鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HB09JY03。为了解其分子特征,对其进行了全基因组测序,并与其他毒株进行了比较。结果表明,HB09JY03分离株的gag和pol基因非常保守,与各参考毒株的同源性为97.5%～99.0%;env基因的同源性为88.4%～97.5%;其3′UTR出现部分rTM区段缺失现象。与参考毒株相比,HB09JY03分离株与HPRS-103株的亲缘关系较近,可作为我国蛋鸡ALV-J株生物学特性和致病机制研究的良好材料。     

云南省猪圆环病毒的分子流行病学调查及其2型cap基因遗传多样性分析

采用猪圆环病毒(PCV)通用PCR技术和PCV-2特异性PCR技术检测云南省2007～2008年采集的120份病猪组织样品,结果获得PCV-2阳性样品21份.选取12份有代表性的阳性样品进行cap基因的扩增、纯化,将产物克隆至pMD18-T载体测序,并与已知参考毒株进行比对及系统发育分析.结果显示,云南省12份阳性样品cap基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为92.4%～99.7%和94.4%～99.6%;与国内PCV-2毒株cap基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为89.3%～92.9%、88.4%～94.0%;与国外毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性为90.0%～99.4%、93.6%～99.6%.有25个氨基酸位点存在变异,其中14个位点位于抗原表位区;12份阳性样品可划分为3个进化分枝(1.1.1.1、1.1.2、1.2),其中1.1.2、1.2可能是新出现的分枝.     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

禽呼肠孤病毒纳米PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感的禽呼肠孤病毒(ARV)检测方法,针对ARV S3基因的保守区域设计1对特异性引物,建立了ARV纳米PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,仅从ARV核酸样品可检测到约332 bp的特异性目的条带,而对新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性囊病病毒、鸡毒支原体、马立克病病毒、传染性喉气管炎病毒、鸭瘟病毒、禽腺病毒Ⅳ型、减蛋综合征病毒、H9亚型禽流感病毒和鸡大肠杆菌等其他病原的检测结果均为阴性。敏感性试验结果显示,该纳米PCR方法能检测到的最低核酸质量浓度为56 pg/L,其灵敏度是普通PCR的10倍。ARV核酸被重复检测3次,结果均一致。应用建立的纳米PCR和病毒分离鉴定方法对临床送检的30份样品进行检测,两种方法的符合率为100%。以上结果表明,成功建立了ARV的纳米PCR检测方法,具有更高的敏感性和良好的特异性,可用于ARV感染的临床诊断及流行病学调查。     

猪细小病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)核苷酸序列,分别设计并合成了3对特异性扩增PPV、PCV2和PRV的引物,扩增片段长度分别为531、466和277bp。经过优化条件,建立了检测PPV、PCV2和PRV的多重PCR方法。采用该PCR方法对23份自然感染病猪样品进行检测,结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果的符合率为100%,同时对临床样品中PPV、PCV2和PRV阳性PCR产物进行测序分析,发现PPV、PCV2和PRV的PCR产物序列与GenBank中公布序列的同源性均达98%以上,证实该多重PCR检测的阳性结果为上述3种病毒。表明,建立的多重PCR方法可用于这3种病毒的临床诊断和流行病学调查。     

屠宰鸡血清和肝中乙型肝炎病毒的检测

采集了129份屠宰鸡血清样品,采用酶联免疫吸附试验检测了鸡血清样品中HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBcAb、HBeAb等乙型肝炎诊断指标;用免疫电镜方法观察了血清样品中乙型肝炎病毒样粒子。采用免疫组织化学技术检测了肝中乙型肝炎病毒相关抗原的分布,并对鸡肝的S基因进行了PCR检测及同源性比对。结果显示,HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBcAb、HBeAb的血清阳性率分别为28.68%、53.49%、17.05%、4.65%和9.3%,其中3份血清同时呈HBsAg、HBeAg阳性,阳性率为2.33%。电镜负染色样品观察可见大量密集排列的病毒样粒子,形态和大小类似于人乙型肝炎病毒Dane颗粒和小球状颗粒。鸡肝中HBsAg、HBcAg免疫组织化学检测结果显示,阳性率为39.06%～62.07%。应用PCR技术扩增出的2株乙型肝炎病毒的核酸序列片段与人乙型肝炎病毒的同源性分别高达92.2%和97.9%。以上结果说明,部分屠宰鸡可能存在乙型肝炎病毒感染。     

J亚群禽白血病病毒SCAU-0901株的分离鉴定

在组织病理学观察的基础上,经接种DF-1细胞系、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),从送检的疑似禽白血病感染的麻黄肉种鸡中分离并鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为SCAU-0901.利用特异性引物分别扩增出长度为545 bp和2.2×103bp的目的片段,并对目的片段进行了克隆测序.序列分析发现,SCAU-0901株的gp85基因与国内外各ALV-J毒株相应核苷酸序列的相似性为86.1%～95.1%,其中与BJ0303株的相似性最高(95.1%),与ADOL-7501株的相似性最低(86.1%).系统遗传进化分析表明,SCAU-0901株的gp85基因片段与BJ0303株的亲缘关系最近.     

网状内皮组织增生病病毒HLJR0901株全基因组的克隆及序列分析

以网状内皮组织增生病病毒(REV)东北分离株HLJR0901基因组为模板,分别用6对引物扩增其全基因组,最终通过拼接和比对确定HLJR0901株的全基因组长8284bp,其基因组结构为LTR-PBS-gag-pol-env-PPT-LTR,GenBank登录号为GQ415646。运用软件将其序列与已知的其他REV全基因组进行比较。结果显示,HLJR0901株不仅与中国台湾和美国的REV毒株有较高的同源性,而且与鹅、野鸟及插入到鸡痘病毒中的REV前病毒有较近的亲缘关系,而与我国南方毒株HA9901的亲缘关系较远,表明我国流行的REV存在多样性。     

绵羊痘病毒固原株的分离与鉴定

取发病绵羊的皮肤痘疹研磨制成病料样品悬液,将该悬液感染未免疫的健康绵羊,同时接种原代绵羊羔羊睾丸(LT)细胞,盲传5代后,转接Vero细胞,进行间接免疫荧光试验和PCR鉴定。样品悬液感染未免疫的健康绵羊后出现绵羊痘的典型发病症状,经过LT细胞传代后转接Vero细胞,出现了特征性细胞病变;间接免疫荧光试验和PCR均检测出病毒存在。PCR产物的核酸序列测定结果显示,分离毒株的RPO30基因与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因的同源性在99%以上。上述结果表明,本研究从宁夏固原市疑似绵羊痘病毒感染的绵羊体内成功分离到1株绵羊痘病毒,并将其命名为绵羊痘病毒固原株。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒分离株SD1009株感染性克隆的构建与病毒拯救

为探究蛋鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,从山东省某鸡场送检的蛋鸡病料中分离鉴定出1株ALV-J,命名为SD1009株,采用PCR方法分3段扩增出SD1009株的前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后顺次连接,获得1个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009。全长测序及序列比对分析发现,近年来分离的ALV-J都存在缺失部分rTM和DR区的序列,缺失长度为205bp。通过外源基因嵌合的方式,将205bp嵌合进入,又获得了1个前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009A205,将pBW-SD1009和pBW-SD1009A205分别转染DF1细胞,通过间接免疫荧光试验,禽白血病抗原试剂盒检测,反转录酶试剂盒检验,表明拯救出了2株病毒,分别命名为rSD1009和rSD1009A205。本研究成功构建了蛋鸡ALV-J的感染性克隆,并在序列分析的基础上,又构建了第2株补全缺失序列的感染性克隆,结果表明缺失部分rTM和DR区的序列,对病毒的拯救以及病毒的复制动力学无显著影响。     

猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。     

兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立

根据已发表的PCV 1和PCV 2全基因组序列 ,设计了 3条引物 ,组成PCV 2的特有引物对和PCV 1、PCV 2的共有引物对 ,分别扩增长度为 4 72bp和 339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性 ,将 4 72bp的扩增产物纯化后 ,克隆到 pMD 18 T载体 ,转化大肠埃希氏菌TG1,对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定 ,并测序。将该序列递交NCBI进行BLAST同源序列比较 ,发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV 2毒株核苷酸序列的同源性均在 99%以上 ,与PCV 1毒株的同源性为 86 %。结果显示 ,该方法最少可用于 3μg病料组织和 0 .75 pgDNA的PCV 2检出 ,具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市 4 7份“猪高热综合征”病料 ,PCV 2感染阳性率为 36 .17% ,PCV 1单独感染阳性率为 34.0 4 %。     

牛结节性皮肤病病毒TaqMan-MGB荧光PCR检测方法的建立

为建立快速、特异鉴别检测牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的方法,本研究参照GenBank中发表的LSDV全基因组序列,设计并合成一对特异性引物和探针,经优化条件,建立了可鉴别LSDV的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法可特异性检测LSDV,而与山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛痘病毒和猪痘病毒均无交叉反应;标准曲线在各浓度范围内呈现良好的线性关系,该方法建立的标准曲线方程为y=-3.141x+32.10,线性相关系数为0.999,扩增效率达到108%,最低检出下限为1.48 copies/L;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%。采用此方法对52份模拟临床样品和112份临床样本的检测结果显示:32份模拟阳性样品检出LSDV核酸阳性,20份模拟阴性样品未检出LSDV;而用OIE推荐的普通PCR方法仅检出28份模拟阳性样品的LSDV核酸阳性,24份模拟样品的LSDV核酸阴性(其中20份为模拟阴性样品,4份为模拟阳性样品);两种方法均未从112份临床样品中检出LSDV核酸阳性。上述结果表明,荧光PCR的敏感性明显优于普通PCR,能够快速准确地检测LSDV,适用于临床样品的检测,为外来疫病防控提供了技术支撑。