脑心肌炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测脑心肌炎病毒(EMCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),参照GenBank中EMCV基因组序列(X74312.1),针对EMCV的3D基因保守区域设计并合成了4条引物,对建立的反应体系进行条件优化,并进行特异性、敏感性试验及临床样本的检测。结果显示,成功建立了EMCV LAMP检测方法,且当内、外引物浓度比例为5∶1(即内、外引物浓度分别为50μmol/L、10μmol/L),反应温度为64℃,反应时间为60min时反应体系可达最佳。特异性和敏感性试验表明,该方法能够特异性地检测EMCV,且敏感性比常规RT-PCR法高10倍。分别用建立的LAMP法与ELISA法对临床样本进行检测,结果二者的符合率为97%。表明建立的LAMP方法特异性强、敏感性高,可适用于EMCV临床样本的快速检测。     

犬瘟热病毒反转录环介导等温扩增诊断方法的建立

根据GenBank中犬瘟热病毒H基因保守序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为247 bp。通过对反应条件中内、外引物的比例、dNTP浓度、Mg2+浓度、反应温度和时间等条件逐一优化,成功建立了犬瘟热病毒的RT-LAMP检测方法。该方法在60℃下保温50 min即可完成,可检测至10-1TCID50的病毒,与常规RT-PCR检测方法相比灵敏度高100倍。对犬腺病毒、犬细小病毒、狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒同时检测,结果显示,本方法具有高度的特异性。     

小反刍兽疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据PPRV基质蛋白(M)基因保守序列设计2对种特异性引物,通过反应条件优化和特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了PPRV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,该方法最佳反应条件为62℃1 h,与口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、狂犬病病毒和犬瘟热病毒这5种羊常见病毒无交叉反应,最低可检测到2.4×10~(-9)ng/L的RNA,敏感性是普通RT-PCR检测方法的1 000倍。该方法与普通RT-PCR的总符合率为95.23%。结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、操作简便、快速和可视化的优点,可用于羊PPRV感染的现场可视化快速诊断检测。     

禽白血病病毒K亚群RT-LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank数据库中禽白血病病毒(ALV)K亚群特异性的gp85基因序列,设计了特异性检测ALV K亚群(ALV-K)的RT-LAMP引物。对内、外引物浓度组合和反应温度进行优化,建立了ALV-K的RT-LAMP检测方法。特异性试验结果显示,本方法只对ALV-K进行特异性扩增,而对禽白血病的其他亚群以及NDV、REV、AIV、MDV、IBV等常见禽病病原未见扩增。敏感性试验表明,本方法最低能够检测到3.4×104copies/L的质粒。     

兔出血症病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种可视化的兔出血症病毒RT-LAMP检测方法,根据兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)的主要结构蛋白VP60基因的序列设计合成4条特异性引物,以重组pMD19-T-VP60质粒为模板,通过反应条件与反应体系优化,建立RHDV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定RT-LAMP对RHDV的最低检测限,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,该RT-LAMP的最佳反应温度为62℃,反应时间为40 min,对RHDV的最低检测限为50 copies/L,常规RT-PCR的检测限为5×10~3copies/L,表明建立的RT-LAMP的灵敏度显著高于常规RT-PCR。建立的RT-LAMP的全部反应可在1 h内完成;反应结束后加入荧光染料Et Br可肉眼判定粉色为阳性,而棕色则为阴性,且与兔巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌、无乳链球菌及肺炎克雷伯菌无交叉反应。上述结果表明,建立的RT-LAMP简便、快速、灵敏、特异,且不需昂贵仪器设备,适合在基层推广应用。     

猪环曲病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速检测猪环曲病毒(PToV)的RT-LAMP方法,根据GenBank中发表的N蛋白基因序列,设计合成4条特异性LAMP引物,通过敏感性试验和特异性试验,建立了PToV RT-LAMP检测方法,并对71份临床粪便进行了检测应用。结果显示,本试验建立的PToV RT-LAMP检测方法在65℃60min条件下可扩增出特异性梯状DNA条带,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪环曲病毒的核酸无交叉反应;检测极限为10copies/μL,比普通RT-PCR的灵敏度高10倍,表明该检测方法具有较强的特异性及灵敏性。用建立的RT-LAMP方法进行的样品检测结果显示,受检的71份样品中有17份检测结果为阳性,该结果与常规RTPCR检测结果吻合,总的阳性率为23.9%。     

马动脉炎病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速、简便、特异性高的马动脉炎病毒反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,针对马动脉炎病毒膜基质蛋白M基因的保守序列设计特异性引物,优化反应条件,建立了马动脉炎病毒的RT-LAMP检测方法并对其特异性和灵敏性进行了检测。结果显示,建立的RT-LAMP检测方法具有良好的特异性,灵敏度为0.12pg,是普通RT-PCR的100倍,检测时间仅需1h,肉眼即可观察检测结果。表明建立的RT-LAMP检测方法可用于进出口马动脉炎病毒的检疫。     

牛支原体牛多杀性巴氏杆菌与牛传染性鼻气管炎病毒三重PCR方法的建立与初步应用

为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、多杀性巴氏杆菌(PM)与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的三重PCR检测方法,笔者设计1对特异性引物,引用文献的2对引物,对反应条件与反应体系进行优化,建立了一种三重PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示,最佳退火温度为51.7℃,最佳引物终浓度均为0.5μmol/L;敏感性结果显示,MB、PM、IBRV的最低检出限分别为3.9×10^-3ng/μL、6.61×10^-2ng/μL与2.97×10^-2ng/μL;特异性结果显示该方法只能特异性检测出MB、PM和IBRV。利用建立的三重PCR方法对108份临床病料进行检测,结果与单一PCR一致。结果表明,该方法可用于临床快速检测MB、PM、IBRV。     

传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的建立及其应用

为建立一种用于快速检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的逆转录环介导等温扩增技术(RTLAMP)方法,设计了针对VP1基因保守序列的5组引物,采用荧光检测试剂通过实时浊度仪监测阳性扩增结果。结果显示,从5组引物中筛选出了1组对IBDV有效扩增的引物,利用该引物能够在63℃、1 h条件下实现IBDV VP1基因片段的特异性扩增,与其他病毒的核酸无扩增反应;样品RNA的最低检出量为5×10-5ng/L;利用建立的检测方法对14份临床样品进行检测,其阳性检出率为100%。结果表明,建立的IBDV RT-LAMP检测方法具有快速、准确、特异性强、灵敏度高和便捷的特点,可用于IBD临床样品的检测。     

猪鼻支原体LAMP快速诊断检测方法的建立

采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以猪鼻支原体的P37基因序列为靶基因,设计1组特异性引物,对反应体系的引物浓度、MgSO_4、dNTPs、反应温度和时间进行优化,并进行了特异性和灵敏度试验,旨在建立猪鼻支原体(Mhr)的简便、快速、准确的分子检测方法。同时应用所建立的方法对临床样品进行检测,结果显示,最佳反应体系为MgSO_46 mmol/L,dNTPs 1.2 mmol/L,内引物(FIP/BIP)1.6 μmol/L,外引物(F3/B3)0.2 μmol/L,Bst DNA聚合酶8 U,60℃扩增60 min。灵敏度是常规PCR的100倍并且与其他病原菌无任何交叉反应。对23份呼吸道疾病临床样品进行检测的结果显示,普通PCR和LAMP的检出率分别为23.4%和79.6%。表明建立的LAMP检测方法可以用于Mhr的常规检疫。     

猪传染性胃肠炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因序列设计2对反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立针对TGEV N基因的RT-LAMP快速检测方法,并对该检测方法的特异性与灵敏性进行了评价。该方法在63℃恒温下作用50min,使TGEV N基因获得了高效率特异性扩增,与猪流行性腹泻病毒等其他猪易感病毒无交叉反应,具有很好的特异性;同时该方法具有极高的灵敏性,可检测到131.4fg/μL的目标病毒DNA,比普通PCR的灵敏度高3个数量级。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。经47份临床样品RT-LAMP检测结果与已得到验证的RTPCR和ELISA结果进行比对,结果显示符合率为100%。     

小反刍兽疫病毒RT-LAMP快速检测和鉴别方法的建立

采用人工合成方法获得小反刍兽疫病毒N蛋白基因的核酸质粒,并利用该质粒进行小反刍兽疫病毒通用型引物和鉴别型引物的筛选。再经过对中国动物卫生与流行病学中心临床样品进行敏感性试验和对最佳引物进行验证,从而建立鉴别小反刍兽疫病毒新疆株和西藏株的RT-LAMP方法。结果显示,在65℃50min内即可完成对小反刍兽疫病毒的检测和鉴别。特异性、灵敏性试验结果表明,建立的RT-LAMP方法中通用型引物的灵敏度与Real-time RT-PCR相当,鉴别型引物的灵敏度是RT-PCR的10倍,临床样品的检测结果表明,本研究建立的RT-LAMP的准确性高于北京世纪元亨公司研制的小反刍兽疫病毒RTPCR检测试剂盒。     

H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种特异、灵敏和快速的H11亚型禽流感病毒(AIV)RT-LAMP可视化检测方法。根据H11亚型AIV HA基因保守序列,设计6条特异性引物,优化反应条件,进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,该方法只能扩增H11亚型AIV,不与其他亚型AIV和禽病病原体发生交叉反应,表明该方法特异性强;对H11亚型AIV RNA的检测下限为10fg,表明该方法敏感性高;在63℃等温条件下作用1h即可完成全部扩增反应;对206份临床样品的检测结果与病毒分离一致。结果表明,本研究中建立的H11-RT-LAMP检测方法具有简便、快速和结果可视化的优点,尤其适合在基层兽医站和养殖场进行快速检测,具有非常广阔的应用前景。     

禽腺病毒4型环介导等温扩增检测方法的建立

为了建立禽腺病毒4型(FAdV-4)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究以FAdV-4 hexon基因高度保守的区域设计LAMP引物,并对反应体系和反应条件进行优化,同时评价该方法的特异性、灵敏度及对临床样品的适用性。结果显示,本研究建立的LAMP方法的最佳反应条件为63℃扩增65 min;反应体系中内外引物最佳比例为8∶1,MgSO₄和dNTP浓度分别为60 mmol/L和10 mmol/L;与FAdV-10、FAdV-8b、FAdV-11、NDV、IBDV、AIV-H9、IBV、ILTV、ORT、CIAV、ALV等均无交叉反应,具有良好的特异性;本方法可检测的DNA最低浓度为7.5×10^-8ng/μL,灵敏度是传统PCR法的100倍。用本研究建立的LAMP法和PCR法对80份临床样品进行检测,结果相符率为90.5%。上述结果表明,本研究建立的FAdV-4 LAMP检测方法具有准确性高、特异性强、灵敏度高和临床应用可行性强的优点,且结果易于判定,便于现场检测,为FAdV-4提供了一种新的现场诊断方法。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立

通过对GenBank中登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白基因序列进行分析,根据p72保守区序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为184bp。通过对反应条件进行优化,建立了非洲猪瘟LAMP检测方法。结果显示,该方法在62℃保温60min即可完成,最低可检测到1×101 copies/μL的病毒DNA,与常规PCR方法相比灵敏度高100倍。对ASFV、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒基因组DNA同时检测,结果仅有ASFV出现条带,而其他均未出现目的条带。表明,建立的ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性和敏感性。     

猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的方法,本研究根据GenBank上登录的FHV-1 UL55序列设计特异性探针及引物,筛选最佳引物对,建立了FHV-1的重组酶介导等温扩增(RAA)检测方法。该方法在39℃反应20 min即可快速、特异性地检测FHV-1。灵敏性试验结果显示,RAA最低检测限为7.60×10¹ copies/μL,比普通PCR最低检测限高100倍。特异性试验结果显示,该RAA方法与猫杯状病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒无交叉反应。对34份临床样本进行检测,其中13份为阳性,阳性检出率为38.23%。综上所述,本研究成功建立了猫疱疹病毒Ⅰ型RAA检测方法。     

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝.分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性.表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测.     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

禽网状内皮组织增生病病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列设计1对针对REVgp90基因的引物和1条特异性TaqMan探针,建立了一种快速检测REV病毒载量的TaqMan荧光定量PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化,使得该方法在1×101～1×108copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到10copies/μL,是常规PCR方法的100倍,该方法与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复性试验变异系数均小于2%。用REV HLJR0901株人工感染1日龄SPF雏鸡,定期剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在肝、脾、法氏囊、胸腺和腺胃中均可检测到病毒,其病毒载量并无明显差异。本研究结果表明,该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于REV的定量检测,为该病毒的诊断及致病性的研究提供了技术手段。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10~8～2.31×10~2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10~1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10~5～1.54×10~6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。