LHR在牦牛肾和卵巢中表达情况的研究

为了探讨牦牛肾中黄体生成素受体(LHR)的表达情况,分析肾中LHR与卵巢中LHR表达的相似性,选取青海省健康的3头2岁龄雌性牦牛,根据黄牛LHR基因序列5′端和3′端的保守性设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测牦牛肾和卵巢组织中LHR基因的表达量,并运用免疫组织化学法对LHR蛋白在牦牛肾和卵巢组织中表达情况进行定位研究。RT-qPCR结果显示,牦牛肾组织中LHR mRNA的相对表达量是卵巢的79.75倍。免疫组织化学结果显示,LHR在牦牛肾组织的近曲小管和远曲小管呈阳性反应,在卵巢组织中卵泡颗粒层呈明显的阳性反应;LHR在牦牛肾和卵巢中的表达量之间差异极显著(P0.01)。结果表明,牦牛的肾组织与卵巢组织一样,均具有表达LHR的特性,提示肾可通过调节LHR参与牦牛的繁殖性能。     

FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期子宫的表达与定位

为探索成纤维细胞因子2(fibroblast growth factor,F2GF2)及成纤维细胞因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)在健康成年牦牛繁殖周期中的生物学功能,本研究选取了不同繁殖周期(发情期-卵泡期、发情期-黄体期、妊娠期-黄体期)牦牛子宫组织,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和免疫组织化学方法从基因和蛋白水平分别检测不同繁殖周期牦牛子宫FGF2和FGFR的表达和分布,用积分光密度方法分析FGF2和FGFR蛋白表达水平。结果显示,不同繁殖周期牦牛子宫中FGF2mRNA表达水平为:发情期-卵泡期发情期-黄体期妊娠期-黄体期(P0.01);FGFRmRNA表达水平为:发情期-黄体期妊娠期-黄体期发情期-卵泡期(P0.05)。FGF2和FGFR在牦牛不同繁殖周期的子宫内膜、子宫腺及血管上皮中均有表达,子宫内膜和子宫腺为主要表达部位,阳性细胞的细胞质中表达较高。积分光密度分析结果显示,FGF2蛋白表达水平为:发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫妊娠期-黄体期子宫;FGFR蛋白表达水平为:妊娠期-黄体期子宫发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫。以上结果表明,FGF2和FGFR在不同繁殖周期的表达差异性可能与其参与早期胚胎附植及胚胎发育的调控相关,这为进一步研究FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期中的调控作用提供了理论依据。     

牦牛S100A12基因的克隆及其在生殖器官中表达情况的检测

为了解S100A12基因在牦牛生殖器官中的表达情况,采用RT-PCR技术从牦牛脾组织中扩增S100A12基因序列,用半定量RT-PCR技术和免疫组织化学染色方法分别检测S100A12基因mRNA和S100A12蛋白在牦牛脾、淋巴结、乳腺及生殖器官中的表达。结果显示,克隆的牦牛S100A12基因序列片段大小为279bp,包含一个完整开放阅读框(ORF),推导编码92个氨基酸;S100A12mRNA和蛋白在脾中表达量相对最高,在睾丸、附睾、淋巴结、乳腺、卵巢中相对强表达,在阴茎、阴道、子宫(子宫角、子宫体和子宫颈)中相对弱表达。结果表明,S100A12mRNA和蛋白在牦牛生殖器官中均有不同程度的表达,提示其在牦牛生殖过程中可能发挥一定的作用。     

BDNF和TrkB在幼犬生殖器官中的表达

为了探讨脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)蛋白在幼犬生殖器官中的表达情况,选取4只40日龄左右的幼犬分别进行手术采集卵巢、子宫、输卵管和睾丸样品,运用免疫组织化学方法分析BDNF和TrkB蛋白在这4种器官中的分布情况。结果表明,BDNF蛋白在卵泡细胞胞质中强表达,在初级卵母细胞中表达较弱,而TrkB仅在卵泡细胞中表达,此外,BDNF和TrkB都在卵巢间质细胞中表达。BDNF和TrkB在子宫内膜上皮和腺上皮以及输卵管黏膜上皮细胞中都有表达,TrkB在子宫和输卵管的固有层和肌层部分细胞中也可见表达。BDNF和TrkB都在睾丸的精原细胞中表达。结果提示,BDNF蛋白对幼犬生殖器官的活动有一定的调节作用,可能通过与其受体TrkB的特异性结合来实现其功能。     

卵泡期和黄体期牦牛输卵管中Bcl-2和Bax的表达变化

为了研究发情周期不同阶段牦牛输卵管中Bcl-2和Bax的表达变化,采用免疫组织化学SP法和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)技术分别对黄体期和卵泡期牦牛输卵管中Bcl-2和Bax蛋白及其m RNA的表达特征进行了研究。结果显示,发情周期不同阶段Bcl-2和Bax蛋白免疫阳性产物主要表达于牦牛输卵管黏膜上皮细胞质中,且主要分布于上皮细胞游离面和基底面。黄体期Bax蛋白阳性产物表达量显著高于卵泡期,而Bcl-2表达量略低于卵泡期,但无显著差异。卵泡期和黄体期牦牛输卵管管壁中有Bcl-2和Bax m RNA表达,不同时期Bcl-2 m RNA变化无显著差异;黄体期Bax m RNA表达显著高于卵泡期。表明,Bcl-2和Bax参与了牦牛输卵管黏膜上皮细胞周期性增殖与凋亡的调控,而且这一凋亡通路中主要通过Bax的变化来实现。     

SPAG11基因在雄性牦牛生殖器官中表达的检测

为了检测精子相关抗原11(sperm-associated antigen 11,SPAG11)基因在雄性牦牛生殖器官中的表达谱并分析其组织表达特性,从牦牛附睾头总RNA中RT-PCR扩增SPAG11基因(SPAG11C、D、E、U、V和W),半定量RT-PCR分析SPAG11mRNA在牦牛生殖器官中的表达水平。采用合成的SPAG11E多肽制备牦牛SPAG11E多克隆抗体,免疫组织化学检测SPAG11E蛋白在睾丸和附睾中的表达及定位情况。结果显示,SPAG11C、U、V和W基因在睾丸和附睾相对低表达,而SPAG11D和E基因相对高表达;SPAG11C和U基因在输精管相对低表达,而SPAG11E相对高表达;除SPAG11D在卵巢相对低表达外,SPAG11基因在其他雌性生殖器官均不表达。免疫组织化学结果显示,SPAG11E蛋白在睾丸的精子细胞和附睾内壁精子头部表达。结果表明,SPAG11基因的表达具有组织特异性,提示它在牦牛睾丸和附睾中可能发挥重要的免疫功能和生殖功能。     

GCNF在牦牛睾丸不同发育阶段中的表达与定位

生殖细胞核因子(GCNF)是核受体超家族的一员。相关研究发现,GCNF在睾丸和卵巢中高表达,可能在配子减数分裂中发挥作用。为探究GCNF在牦牛睾丸中的表达与定位,采集牦牛不同发育阶段(幼年、成年、老年)的睾丸组织,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测GCNF基因在组织中的相对表达量;采用Western-blot(WB)检测GCNF蛋白在不同年龄阶段睾丸中的表达水平;免疫组织化学方法分析GCNF在牦牛睾丸分布特征。qRT-PCR和WB检测结果显示,GCNF在牦牛睾丸不同年龄阶段均有表达,且表达存在差异性。幼年期GCNF在基因水平和蛋白水平表达量最高且显著高于成年期和老年期;老年期显著高于成年期,成年期表达量最低。免疫组织化学结果显示:在睾丸不同发育阶段GCNF的表达定位无明显差异,主要在生精细胞和圆形精子细胞中表达,间质细胞和支持细胞中也有少量表达。上述研究结果表明,GCNF可能参与精子的发生及分化变形,这为牦牛生殖生育研究提供了理论基础和新的依据。     

绵羊生殖器官GDF9基因的表达研究

生长分化因子9(GDF9)是绵羊多胎性状的重要候选基因,探讨GDF9在不同发育时期的母羊生殖器官的表达规律,对揭示其调控母羊生殖器官的发育具有重要的意义。以2月龄(性成熟前)、6月龄(性成熟)和12月龄(性成熟后)这3个不同生理阶段的雌性绵羊卵巢、输卵管、子宫内膜为对象,采用RT-PCR技术分析GDF9蛋白在相应生殖器官中的表达,并分析其相对表达量;采用免疫组织化学法对GDF9基因在相应生殖器官中的表达进行定位分析。荧光定量PCR结果显示,GDF9在2月龄与6月龄间、2月龄与12月龄间的卵巢上均表现出极显著的差异性(P0.01),而6月龄与12月龄则无显著性差异(P0.05);GDF9在2月龄与6月龄间的子宫内膜上表达无显著差异(P0.05),而在2月龄与12月龄间、6月龄与12月龄间的子宫内膜上的表达均差异显著(P 0.05);GDF9在3个年龄间的输卵管上的表达均无显著性差异(P0.05)。免疫组织化学试验结果显示,GDF9蛋白在2月龄、6月龄和12月龄绵羊子宫内膜和输卵管的上皮细胞及卵巢的颗粒细胞上均能表达,说明GDF9在不同生理阶段的绵羊生殖器官上表达且存在特异性细胞定位。     

成年牦牛几种主要组织细胞中胞红蛋白的分布

为了探讨胞红蛋白(CYGB)在成年牦牛不同组织细胞中的分布特征,选择健康成年牦牛8只,利用免疫组织化学染色SP法观察CYGB在成年牦牛不同组织细胞中的分布特征。结果显示,CYGB在成年牦牛大脑和小脑皮质部与髓质部、脊髓、肾上腺皮质部、垂体、松果体、胰岛、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胃、肠、肝、唾液腺、心肌、骨骼肌、脾、肺和肾等组织细胞中均有表达,CYGB免疫阳性物质主要定位于细胞质。此外,在牦牛皱胃胃底腺、小肠腺以及十二指肠腺分泌细胞中也发现有CYGB阳性表达。在肾上腺髓质部和肾的肾小球内未见CYGB阳性表达。结果表明,CYGB在成年牦牛多种组织细胞中广泛分布,CYGB在这些组织的氧利用及功能活动中发挥作用。     

雌激素受体在间情期绵羊输卵管上皮细胞中的表达

为探讨膜性雌激素受体GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1)及雌激素核受体ERα、ERβ在绵羊输卵管上皮细胞中的表达和定位,探讨三种受体在间情期绵羊输卵管中的表达规律,通过RT-qPCR方法和免疫印迹方法分别检测了三种受体基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组化法对输卵管组织中三种受体基因进行定位并对结果进行光密度值分析。结果,输卵管上皮细胞中GPER相对表达量高于ERα、ERβ(P0.01),ERα的相对表达量高于ERβ(P0.05)。免疫组化结果显示,GPER广泛分布于绵羊输卵管上皮细胞中,主要定位于细胞膜及细胞质。而ERα及ERβ主要分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核。阳性细胞光密度分析结果与荧光定量RT-qPCR的分析结果相一致。上述结果表明,间情期绵羊输卵管上皮细胞中同时存在GPER、ERα、ERβ三种雌激素受体表达,且GPER的平均光密度、mRNA相对表达量最高,ERβ的平均光密度、mRNA相对表达量最低。     

牦牛舌抗菌肽基因cDNA的克隆及其在生殖系统中的表达

为了解牦牛舌抗菌肽(LAP)基因序列的特征及其在生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR法从牦牛睾丸、附睾组织中扩增LAP基因,重组到pMD19-TSimple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR检测了雌性牦牛生殖系统(卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织)中LAPmRNA的表达。结果显示,克隆的LAP基因包含一195bp的完整开放阅读框(ORF),与牛LAP基因相似性达97.9%,该ORF编码的64个氨基酸含有β-防御素特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基;LAP在牦牛生殖系统上皮组织中均有表达。推测LAP在牦牛生殖系统的先天免疫中具有重要作用。     

HSP27慢病毒载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

热休克蛋白27(HSP27)是一种结构上高度保守的小分子热休克应激蛋白,它可通过与细胞自噬、细胞凋亡和天然免疫信号通路关键因子相互结合参与多种病毒的感染过程。为了便于深入研究HSP27在机体抗感染免疫中的作用,用PCR方法从A549细胞中扩增出HSP27片段,然后经双酶切、连接、转化等步骤获得HSP27的慢病毒表达载体pTRIP-HSP27,将此载体和另一对照载体pTRIP-EGFP分别转染至HEK-293T细胞中,48 h后收集慢病毒将其转导至A549细胞,经嘌呤霉素筛选获得过表达HSP27的细胞株A549-HSP27和过表达EGFP的对照细胞株A549-EGFP。最后,经RT-qPCR、Western-blottin、gIFA和细胞活力检测等方法进行鉴定,获得了能稳定表达HSP27的细胞株。     

胰岛素样生长因子及其受体mRNAs在绵羊生殖系统中的表达和分布

为检测胰岛素样生长因子(IGFs)及其受体(IGFR)mRNAs在绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管中的表达,探讨绵羊胚胎早期发育过程中其发育环境——生殖道中生长因子的表达、分泌及其作用,取绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管,经固定、切片、免疫染色,观察IGFs mRNAs的表达和分布情况。同时用RT-PCR技术研究了各组织中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR mRNAs的表达情况。结果表明,IGFs mRNAs在绵羊发情周期早期的卵巢、子宫和输卵管中都有表达,4种因子表达模式相似:在卵巢中,IGFs主要定位于卵泡颗粒细胞,间质细胞亦有少量表达。在输卵管中,上皮细胞免疫染色呈阳性;在子宫中,腺细胞及上皮细胞的阳性信号强于固有层。RT-PCR检测表明IGFs mRNAs在3种组织中均有表达。     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

不同生理状态下牦牛乳腺组织中SREBP1的表达

固醇调节元件结合蛋白1(Sterol regulatory element binding protein,SREBP1)作为一种核转录因子,与哺乳动物体内胆固醇及脂肪的生成密切相关。为了解牦牛乳腺组织中乳脂合成的机制及其特点,采集处于不同生理状态下(妊娠期、泌乳期、干奶期)的乳腺组织样品,采用qRT-PCR、Western-blot及免疫组化(immunohistochemistry,IHC)等技术检测SREBP1基因及其蛋白的相对表达情况。结果显示,泌乳期牦牛乳腺组织中SREBP1 m RNA表达量显著高于妊娠期和干奶期(P0.05),且妊娠期SREBP1 m RNA表达量高于干奶期(P0.05)。在牦牛不同生理状态下,SREBP1蛋白表达也发生了显著变化,妊娠期和泌乳期SREBP1蛋白表达量显著高于干奶期(P0.05)。免疫组化法定位检测结果显示,SREBP1蛋白主要分布在牦牛乳腺腺泡上皮细胞、乳腺导管上皮细胞及血管内皮细胞。上述结果表明SREBP1及其编码m RNA的表达在牦牛乳腺组织中与其所处不同生理状态密切相关,妊娠期和泌乳期SREBP1的高表达,可能意味着其在牦牛乳腺发育和乳脂合成的过程中发挥着重要作用。本研究为进一步探明SREBP1在牦牛乳脂合成调控中的作用积累了一些基础资料。     

SAA与HP在奶牛活体和离体炎性子宫内膜上皮细胞中表达的研究

为研究奶牛子宫内膜炎时急性期蛋白SAA和HP的分子表达规律,采集奶牛子宫组织,通过病理学研究鉴定出不同炎症强度的子宫组织样本;同时体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞,以致炎因子细菌脂多糖(LPS)诱导建立了细胞炎症模型。应用RT-qPCR检测子宫组织和细胞炎症模型中SAA和HP基因的表达变化,以Western-blot检测子宫组织中SAA蛋白的表达变化。结果显示,在子宫组织中,SAA基因与蛋白的表达水平均与子宫内膜炎强度呈正相关,然而HP基因表达水平与组织炎症强度无显著相关性。此外,在子宫内膜上皮细胞体外炎症模型中,SAA基因表达水平与LPS剂量呈正相关,而HP基因表达水平呈负相关。结果表明,子宫组织中和体外培养的奶牛子宫内膜上皮细胞中都能表达SAA和HP。作为急性期反应的生物标记,与SAA相比,HP可能对炎症更敏感,其基因表达更早更迅速。     

牦牛子宫及卵巢动脉的铸型研究

为研究牦牛子宫及卵巢动脉的结构特点及供血特征,本文利用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)血管铸型技术,对20例未发情的健康成年牦牛子宫及卵巢动脉进行离体铸型标本制作和观察。结果发现,牦牛的子宫动脉非常丰富,分为上行支和下行支。上行支在子宫角部发出卵巢支和输卵管支,与卵巢动脉吻合;下行支主要向子宫体和子宫颈供血,并且两侧子宫动脉下行支有吻合现象;卵巢动脉分支包括卵巢支,子宫支,输卵管支;卵巢支呈高度盘曲的螺旋状,尤其在近卵巢门端呈拳头状或球紧密盘绕。上述结果表明,牦牛具有丰富发达的子宫动脉,可能是为了适应高原低氧环境的一个重要的形态学特点。牦牛的卵巢动脉呈高度盘曲的螺旋状可能是为了维持血压的稳定,保证了性腺在动物生殖过程中供血的稳定性及优势卵泡的发育成熟。     

山羊STING和TBK1基因组织特异性表达和分布的研究

干扰素刺激基因(STING)和TANK结合激酶1(TBK1)是介导宿主Ⅰ型干扰素抗病毒应答的关键因子。为深入研究STING和TBK1在山羊天然免疫应答中的作用,采用RT-qPCR方法进行了STING和TBK1组织特异性表达检测,并进行了其组织分布的研究。由于物种差异较大,缺乏山羊STING的商品化抗体,本试验首先利用原核表达的STING蛋白制备了多克隆抗体。结果显示,利用原核表达的STING重组蛋白免疫新西兰大白兔后,经ELISA和Western-blot证明获得了特异性好的多克隆抗体。组织特异性表达检测结果显示,STING在肠系膜淋巴结、心脏和脾的相对表达水平较高,而TBK1在大脑、肝、心脏和肾的相对表达水平较高。免疫组织化学检测结果显示,在心肌细胞、肝细胞、淋巴细胞、细支气管上皮细胞、肾小管上皮细胞和大脑皮层神经元中均呈STING和TBK1阳性。研究结果为进一步探索STING和TBK1在山羊天然免疫应答中的作用提供了基础数据。     

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆表达及表达产物的免疫保护效果的评估

为掌握日本血吸虫钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)特性并评估其作为候选疫苗分子的潜力,采用PCR方法扩增日本血吸虫CNB基因,构建重组质粒pET-28a(+)-CNB,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用His-Bind亲和层析纯化获得重组蛋白rCNB。Western-blot结果显示,rCNB能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有较好的免疫原性。免疫组织化学分析表明,CNB主要分布在日本血吸虫虫体的睾丸、卵巢等生殖器官中,在表膜中也有少量分布。用重组蛋白rCNB结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,结果 rCNB诱导小鼠产生了27.93%(P0.05)的减虫率和42.93%(P0.01)的肝减卵率。结果表明,日本血吸虫CNB具有一定的免疫保护效果,为深入研究日本血吸虫钙调神经磷酸酶的生物学功能奠定了基础。     

牦牛FGF18基因的克隆及其在子宫中表达水平的检测

为研究牦牛FGF18(fibroblast growth factor 18)基因的序列特性及其在子宫中的表达水平,根据黄牛FGF18基因序列5′端和3′端的保守性设计特异性引物,RT-PCR扩增之后通过基因克隆得到牦牛FGF18基因,利用生物学软件对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测了FGF18基因在妊娠早期和非妊娠期牦牛子宫中的表达情况。结果显示,牦牛FGF18基因序列编码区长624bp,编码207个氨基酸,其中赖氨酸含量最高,约为9.7%;同源性分析和系统进化树显示,它与黄牛FGF18基因的同源性最高,为99.7%,表明FGF18基因在进化中具有高度保守性;编码产物的主要功能是胁迫应答和信号转导,与IL-1有相似的结构域,并且含有典型信号肽,整体表现为亲水性。QRT-PCR检测结果显示,FGF18基因在妊娠早期牦牛子宫中的表达量是非妊娠期子宫中表达量的24.7倍,说明FGF18蛋白在牦牛胚胎的早期发育中起着重要作用。