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采用RT-PCR从旋毛虫中扩增出谷氨酸脱羧酶(TsGAD)基因全长,将其克隆到表达载体pET-30a(+)后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,应用比色法鉴定表达产物(rTsGAD)的酶活性,并用纯化的GAD蛋白制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-TsGAD,经SDS-PAGE分析,rTsGAD蛋白的分子质量约为57ku。利用比色法测得粗提的rTsGAD具有酶活性,酶活力为1.5U。制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶65 536。Western-blot分析结果显示,该多克隆抗体与TsGAD具有较强的反应性。结果表明,本试验成功原核表达了rTsGAD,并制备了多克隆抗体,为TsGAD定位以及进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。 相似文献
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采用粪便检查法、幼虫培养法和蠕虫学剖检法对黑龙江省松花江地区羊胃肠道线虫虫卵排出与成虫寄生的季节动态进行了研究。结果表明,成年羊胃肠道线虫的虫卵排出量和成虫寄生量于5月出现一次明显的春季高潮,8月又出现一次较小的高峰,而一年的其他时期,虫卵排出量和成虫寄生量很低。羊胃肠道线虫的优势虫种是捻转血矛线虫、哥伦比亚食道口线虫、羊仰口线虫、毛圆线虫和毛首线虫。羔羊粪便中最早检获虫卵的时间是6月下旬,一年内虫卵排出量只在7月下旬出现一次高峰。研究结果对控制黑龙江省羊消化道线虫病有十分重要的意义。 相似文献
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应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子表面抗原3-1E基因,再克隆至质粒载体pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-3-1E,采用EcoR I+Hind III双酶切法及PCR扩增鉴定正确后,将3-1E基因cDNA目的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a-3-1E,用EcoR I+Hind III双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确.表达蛋白的SDS-PAGE分析表明,表达产物与预期大小(36.47 ku)一致,为可溶性表达.对诱导时间以及IPTG浓度的优化结果表明,当诱导6 h且IPTG浓度在0.8 mmol/L时表达量最大.Western-blot分析表明,表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异性识别.将重组3-1E蛋白纯化后分为肌注蛋白组和肌注蛋白加弗氏完全佐剂组免疫AA鸡,通过计算抗球虫指数检测其保护力.结果显示,肌注重组蛋白组与肌注重组蛋白加弗氏完全佐剂组均能刺激鸡体产生一定的免疫反应,对柔嫩艾美耳球虫感染产生有力的保护,其中后者优于前者,表明该重组3-1E蛋白具有研制成亚单位疫苗的潜力. 相似文献
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以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。 相似文献
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为比较柔嫩艾美球虫(Eimeria tenella)与鸡的组蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3,HDAC3)蛋白质序列和结构差异,以发现和筛选E.tenella HDAC3(EtHDAC3)的特异性抑制物。用RTPCR方法从杂交黄羽肉鸡的肠上皮细胞克隆ChHDAC3基因,以原核表达载体pMAL-C2X构建重组质粒pMAL-C2X-ChHDAC3,经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌Transetta,进行IPTG诱导表达。使用Swiss-Model对ChHDAC3和EtHDAC3进行同源建模,比较分析ChHDAC3和EtHDAC3的活性位点。利用Autodock 4.2进行分子对接,研究抑制剂Apicidin与ChHDAC3、EtHDAC3结合模式的差异。结果显示,克隆的ChHDAC3基因的ORF由1 287个核苷酸组成,编码428个氨基酸,能在大肠杆菌中进行可溶性表达。构建的ChHDAC3和EtHDAC3的三维模型均由8个串联的β折叠和11个α螺旋组成,其活性位点高度保守,仅在表面识别区有1个氨基酸的差异。Apicidin与EtHDAC3有更低的结合能,提示Apicidin对EtHDAC3具有更强的抑制活性和选择性。 相似文献
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根据GenBank中已发表的布氏旋毛虫HSP70基因序列设计了1对引物,用Trizol法从本地毛形线虫肌幼虫虫体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增了HSP70基因,将目的基因克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α。重组质粒用PCR、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行单、双酶切鉴定。测序结果表明,成功克隆了本地毛形线虫HSP70基因。序列分析表明,HSP70基因比较保守,不同物种之间氨基酸的同源性在40%~80%。与布氏旋毛虫HSP70序列相比,CDS区多出9个碱基,但核苷酸序列和氨基酸同源性分别为98%和94%,存在1个糖基化位点和1个潜在的信号肽位点。 相似文献
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为探讨旋毛虫ES抗原对RAW264.7细胞TLR2/4mRNA表达的影响,分别取经0、2、5、15、30、45μg/mL ES抗原作用24h的RAW264.7细胞和用15μg/mL ES抗原作用0、3、6、12、18、24h后的RAW264.7细胞,采用半定量PCR方法检测TLR2和TLR4mRNA的表达水平变化。结果显示,随着ES抗原浓度的升高,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,15μg/mL ES抗原组与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。在15μg/mL ES抗原作用24h内,随着作用时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,作用18h后的表达水平升高,且与空白对照组差异显著(P<0.05)。证实,ES抗原可刺激RAW264.7细胞表面受体TLR2/4表达升高,且存在一定的剂量和时间效应。 相似文献