长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

鸡myostatin基因成熟区段DNA的克隆及其在甲醇酵母中的融合表达

根据GenBank中鸡myostatin(AF019621)成熟区段的cDNA序列设计了1对引物,利用PCR技术扩增了萧山鸡myostatin的成熟区段,构建了重组真核表达载体myostatin-pPIC9K,并在甲醇酵母中融合表达了myostatin蛋白。结果发现,萧山鸡myostatin基因存在2处碱基变异:T204→C204(编码的氨基酸没有变),C205→T205(编码的氨基酸由Pro变成Ser),从而产生了1个EspⅠ或Bpu1102Ⅰ限制性内切酶酶切位点。核苷酸序列同源性分析表明,myostatin基因成熟区段DNA在不同物种间具有高度的保守性。SDS-PAGE鉴定结果表明,表达的目的蛋白(26 ku)具有生物学活性。     

长毛兔和獭兔IFN-γ基因的克隆与真核表达及表达产物的生物学活性

为扩增长毛兔和獭兔IFN-γ基因及检测其真核表达重组体的生物学活性,采用RT-PCR法从德系安哥拉长毛兔和白色獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增了IFN-γ基因,测序并序列分析;将该基因亚克隆入pVAX1载体,转染COS-7细胞,MTT法检测其生物学活性。结果表明,长毛兔和獭兔IFN-γ基因大小均为504 bp,两序列间仅在492位存在1个碱基的变异(A→T)。两序列推导的氨基酸序列相同,含167个氨基酸残基。长毛兔和獭兔IFN-γ核苷酸同源性为99.8%,与国内外学者报道的兔IFN-γ核苷酸同源性分别为100.0%和99.8%。基于NJ法构建的进化树发现,国内外学者所报道兔的不同品种均聚类在一起。通过脂质体法转染COS-7细胞,获得具有一定生物学活性的IFN-γ蛋白。结果表明,不同兔品种的IFN-γ基因间差异极小,具有较近的亲缘关系;且pVAX1-IFN-γ转染细胞后能表达具有生物学活性的蛋白。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

单核细胞增生李斯特菌野毒株prfA基因的克隆及其分子特征分析

利用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(LM)TA野毒株prfA基因进行扩增,将其克隆后测序,并对该分离株prfA基因及其编码蛋白进行分子特征和遗传变异分析。结果显示,TA株prfA基因全长为714bp,编码237个氨基酸。通过对推导的prfA蛋白氨基酸序列结构域分析发现,该蛋白从N端到C端分别包括1个β-环结构域(18～97aa)、1个α-螺旋构成的C区(110～136aa)、1个α-螺旋构成的D区(136～155aa)、1个由螺旋-转角-螺旋构成的HTH结构域(170～196aa)和1个由α-螺旋构成的亮氨酸拉链G区结构域(211～237aa)。通过对GenBank中登录的35株分离株prfA基因遗传变异分析发现,不同地域分离株的prfA基因在核苷酸水平以点突变为主;TA株第197位氨基酸由赖氨酸(Lys,K)突变为天冬氨酸(Asn,N)。     

柔嫩艾美球虫pEtK2抗原基因的克隆表达及其表达产物的抗原性分析

应用RT-PCR技术从纯化的柔嫩艾美球虫孢子化卵囊子孢子中克隆了pEtK2抗原基因,并进行了原核表达和抗原性分析,同时用MTT法检测了重组蛋白对球虫耐过鸡淋巴细胞的刺激效果。结果显示,克隆的pEtK2基因全长1464 bp,具有一个完整的开放阅读框,编码487个氨基酸,具有多个T细胞表位。重组蛋白诱导5 h后表达量最多,分子质量约55 ku,占菌体总蛋白的32%。纯化的重组蛋白能够刺激球虫耐过鸡T淋巴细胞增殖,可作为球虫基因工程疫苗或DNA疫苗的候选基因。     

鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK和鸡IFN-γ重组质粒的构建与体外表达

采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达并纯化重组蛋白,经免疫印迹分析该蛋白的生物学活性。结果显示,成功构建了共表达IFN-γ-CDPK融合基因的原核表达载体,表达纯化了具有良好的免疫反应性的IFN-γ-CDPK融合蛋白,表达纯化的IFN-γ-CDPK融合蛋白能够和鸡柔嫩艾美耳球虫甘肃株抗血清发生特异性结合,为进一步研制高效力的鸡球虫新型基因工程疫苗奠定了基础。     

禽脑脊髓炎病毒 VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株VP3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;并将其与其他小RNA病毒进行了比较     

小鼠AIM2分子结构特征及天然免疫模式识别功能的研究

应用RT-PCR技术,从小鼠脾淋巴细胞中克隆AIM 2基因,通过生物信息学软件对AIM2的遗传演化关系、分子结构特征以及氨基酸序列进行分析,并应用q RT-PCR检测在不同组织中的m RN A转录水平。结果显示,克隆的小鼠AIM2基因开放阅读框全长1 065 bp,编码354个氨基酸,与其他动物的AIM2基因序列具有较高的同源性(56.9%~88.9%);q RT-PCR检测表明,AIM2基因在肌肉和心脏组织中转录水平较高。此外,将AIM2基因亚克隆至真核表达载体p CMV-Tag 2B进行W estern-blot验证,然后将正确的重组表达质粒转染H EK 293T细胞,进而应用双荧光素酶报告系统检测证实在poly(d A-d T)和poly(d G-d C)刺激下,过表达小鼠AIM2对转录因子NF-κB和AP-1的活化过程有显著增强作用。上述研究结果表明,小鼠AIM2能够识别富含A/T或C/G的D NA,是重要的胞浆DNA识别受体,这为进一步探讨AIM2与DNA病毒的相互作用机制奠定基础。     

新型抗体的研究概况

新型抗体是利用生物技术改建和生产的抗体,是近年生物技术研究的一个崭新领域。新型抗体的出现,既扩展了抗体的界限,又延伸了抗体的应用范围,其研究结果不仅显示出重要的理论价值,而且在疾病的预防和诊疗上的意义也日趋明显。目前,已研制和正在研制的新型抗体,大致可归纳成两大类——重组型抗体和新功能型抗体。(一)重组型抗体利用基因工程技术改建生产的抗体,其生物活性仍保持原抗体活性,主要包括有单链抗体、嵌合抗体和重构抗体等。1.单链抗体(Single chain antibody):该抗体由全抗体的部分重链和轻链的可变区,通过一连接肽(约15～25个氨基酸)共价连接起来的重组分子。1988年美国Genex Corp公司的Bird等首先研制出这种抗体。他们在弄清牛生长激素的McAb重链和轻链基因序列的基础上,通过计算机处理抗体X晶体显像,算出可变区三维空间结构及两条链的自然结合状态,设计出编码两个可变区肽段和一个连接肽的融合基因,插入载体,在E.co-li中获得表达。单链抗体是抗体的最小结构单位,     

鸡白细胞介素-6-2嵌合基因的融合表达及其表达产物活性的研究

为研制具有鸡白细胞介素-6、2(ChIL-6,ChIL-2)协同免疫增强作用的鸡基因工程复合免疫增强剂,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法将ChIL-6和ChIL-2基因构建成ChIL-6-linker-ChIL-2嵌合基因;对嵌合基因进行原核表达,采用自行创新的专利纯化方法对表达的rChIL-6-linker-ChIL-2蛋白(重组融合蛋白)进行纯化。采用间接ELISA方法检测重组融合蛋白分别与抗ChIL-6、抗ChIL-2单克隆抗体的特异性免疫反应活性,采用MTS法检测重组融合蛋白体外促鸡外周血T淋巴细胞和脾淋巴细胞的增殖活性。结果显示,成功构建了ChIL-6-linker-ChIL-2嵌合基因及其重组表达质粒rpQE-30-ChIL-6-linker-ChIL-2,表达的重组融合蛋白的分子质量约为40ku,纯化后的纯度在96%以上。该重组融合蛋白可分别与抗ChIL-6、抗ChIL-2单克隆抗体发生特异性免疫反应,并具有显著的促鸡外周血T淋巴细胞和脾淋巴细胞增殖活性,其活性优于任一重组蛋白对照。本研究结果初步证明了rChIL-6-linker-ChIL-2蛋白在对鸡免疫细胞的增殖作用方面与rChIL-6和rChIL-2蛋白的作用相似,为进一步研究rChIL-6-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内的活性奠定了基础。     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因,将扩增产物与pGEM-T easy载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting;用所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体,验证其免疫原性。结果显示。所克隆的T24基因片段长716 bp。含有1个678 bp的开放阅读框,其编码226个氨基酸,与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％;表达的融合蛋白大小为40 ku,并能被猪囊虫阳性血清识别;免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体,第30 d达到较高水平,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及其重组腺病毒表达载体的构建

采用RT-PCR技术对猪瘟病毒(CSFV)E2基因进行了克隆、测序和特征分析.结果,得到了长度为1100 bp、编码367个氨基酸残基的目的基因片段.将克隆到的E2基因插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒中.再将重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-E2用Pine Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组成功获得了含有CSFV E2基因的重组腺病毒表达载体.     

多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶基因的原核表达及其表达产物的酶学活性分析

为探讨多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶(C u/Zn-SO D)基因的特征及该酶在多头带绦虫上的抗氧化作用,采用RT-PCR技术扩增脑多头蚴C u/Zn-SO D基因,构建原核表达载体p ET-32a-C u/Zn-SO D;然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;对表达产物进行W estern-blot检测,并进行酶比活性分析。结果显示,多头带绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列与猪带绦虫和肥头绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列的相似性分别为98%和92%;纯化后的多头带绦虫重组Cu/Zn-SOD蛋白的浓度为1.587 m g/m L;用羟胺法测得该重组蛋白的酶比活性为3 125.64 U/mg±76.82 U/mg;H2O2、SDS和EDTA对重组的多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性具有较强的抑制作用,而氯仿-乙醇和脲素则对多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性并无影响。上述结果为进一步研究多头带绦虫C u/Zn-SO D基因的生物学功能奠定了基础。     

牦牛hepcidin基因编码区的克隆和原核表达

采用RT-PCR从牦牛肝中扩增到了hepcidin基因,将其克隆至pGEM-T载体,转化DH5α感受态细胞,获得了阳性重组质粒,牦牛hepcidin基因编码区长289 bp,编码82个氨基酸(GenBank:EU863791);与黄牛相比,牦牛hepcidin基因编码区序列存在1个碱基的变异,但未引起氨基酸的改变;将牦牛hepcidin基因编码区连接至pGEX-4T-1表达载体,成功构建了原核表达栽体pGEX-4T-hepcidin;IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示,35 ku处有特异性蛋白条带,表明牦牛hepcidin抗菌肽基因成功实现了原核表达.     

猪热休克蛋白70基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中收录的猪HSP70基因序列,设计了1对特异性引物.运用RT-PCR技术从经热应激诱导的大约克猪组织总RNA中扩增得到了HSP70基因.并将其克隆至pMD18-T Simple载体上,进行序列测定.将编码猪HSP70的基因亚克隆至pET-32a(+)上,并将重组质粒pET-32-pHSP70在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中经IPTG诱导表达.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长2 200 bp,含1 932bp的开放阅读框,编码643个氨基酸,与已知猪HSP70核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达99.5%.SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,猪HSP70在BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达.     

猪链球菌2型噬菌体裂解酶催化域A5的关键氨基酸位点的鉴定

为了鉴定猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)噬菌体裂解酶(Ly ACCG/Ly ACC)催化域A5的关键氨基酸位点,本研究利用NCBI、Pfam和Uniport数据库,对催化域A5的氨基酸序列中的各位点的保守性进行了比对分析;以噬菌体SMP基因组为模板,PCR扩增lyacc基因,测序分析后构建原核表达质粒p SJ2-lyacc;以质粒p SJ2-lyacc为模板,通过PCR扩增的方法将催化域A5中3个高度保守的氨基酸位点(30位的天冬氨酸/D30、53位的苏氨酸/T53和95位的甘氨酸/G95)的密码子分别定点突变为丙氨酸(A)的密码子,经测序确证后将突变体质粒p SJ2-lyacc/D30A、p SJ2-lyacc/T53A和p SJ2-lyacc/G95A分别转化BL21(DE3)感受态细胞,同时将质粒p SJ2-lyacc作为对照平行转化,用IPTG于27℃诱导表达,菌体重悬后超声裂解,上清液过滤,获得的蛋白粗提液经SDS-PAGE分析,表明重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的分子质量均约为30 ku;将重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的蛋白粗提液用于平板裂解试验,结果显示,原核表达的重组Ly ACC的裂菌圈直径为2.2 cm;突变体G95A的裂菌圈直径仅为1.4 cm,裂菌活性部分降低;突变体D30A和T53A的裂菌圈消失,彻底失去裂菌活性。上述结果表明,D30和T53是Ly ACC的关键氨基酸位点。     

鹅IL-18基因的克隆和原核表达及其多克隆抗体的制备

参考GenBank中鸡、火鸡和鸭IL-18基因序列,设计了1对特异引物,以提取的鹅脾细胞总RNA为模板,应用RT-PCR扩增、克隆鹅IL-18基因中间的333bp序列。序列分析结果表明,其与鸭IL-18基因对应序列相似性最高,达99%。参考鸭IL-18全基因序列设计上、下游引物各3条,以梯度PCR探索扩增、克隆鹅IL-18全基因。以上述策略成功扩增、克隆了3个广东地方杂交品种鹅的IL-18基因。序列分析表明,这3个杂交品种鹅的IL-18基因序列一致,长642bp,含一个603bp的ORF,编码200个氨基酸,分子质量为23.2ku。ORFN端的30个氨基酸为前导序列,其余170个氨基酸为功能蛋白序列。在GenBank中注册了第一条鹅的IL-18基因序列,登录号为EF159728。随后,构建了鹅IL-18基因ORF的重组原核表达质粒pET-GIL-18,经诱导表达、纯化获得重组鹅IL-18融合蛋白,并以其制备了兔抗重组鹅IL-18多克隆抗体。