五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病痛毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描.结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合.用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份.表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景.     

长江中下游地区规模化猪场猪繁殖障碍性疾病的病原学检测

应用PCR与RT-PCR方法,检测了127份来自于长江中下游地区7省市24个规模化猪场患繁殖障碍的病猪的病料,检测病原包括猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及日本脑炎病毒(JEV).结果显示,在上述127份样品中,有10份样品为PRRSV单独感染,占检测样品数的7.87%,有54份样品为PRRSV与PPV混合感染,占样品总数的42.52%,有50份样品为PRRSV与PCV-2混合感染,占样品总数的39.37%;有15份样品为PRRSV与PRV混合感染,占样品总数的11.81%;有8份样品为PRRSV与JEV混合感染,阳性率为6.30%;有18份样品为PRRSV与CSFV混合感染,占样品总数的14.17%.提示,长江中下游地区规模化猪场的猪群普遍存在PRRSV与PPV、PCV-2、JEV及PRV的混合感染.     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果显示,所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在,161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86.95%。从上述样品中随机抽取28份样品,用PCR方法检测了PCV2 ORF1基因;结果,从13份血清中扩增到了特异性PCV2 ORF1基因,阳性率为46.42%。证实,西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

猪凸隆病毒猪嵴病毒猪捷申病毒猪轮状病毒多重荧光RT-PCR方法的建立与初步应用

为建立一种同时检测猪凸隆病毒、猪嵴病毒、猪捷申病毒和猪轮状病毒的高特异性、高灵敏性的检测方法,根据这4种病毒的保守基因序列分别合成相应的特异性引物及TaqMan探针,采用One-Step法进行反应体系的优化,建立多重荧光RT-PCR方法,评估该方法的特异性、敏感性、重复性,并用于本地猪场腹泻样品中上述4种病毒的流行病学调查。结果显示：该方法特异性好,可特异性地检测上述4种病毒的单一模板及混合模板,其他对照株均无扩增信号;灵敏度高,上述4种病毒的最低检出限均为10¹ copies/μL;重复性好,批内及批间重复试验变异系数均小于3%。所建立方法还具有高通量、低污染和操作简便的优点,3 h内即完成全市猪场265份腹泻样品的检测,大大提高了检测效率。流行病学调查显示,厦门市养猪场猪嵴病毒、猪捷申病毒、猪轮状病毒和猪凸隆病毒这4种病毒均具有较高的检出率,阳性率依次为67.92%、65.28%、36.60%和27.55%。该研究将为猪腹泻病鉴别诊断及防控提供重要的技术支持。     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法(IPMA),并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验,并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示,用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品,第1周抗体阳性检出率为50%,从第2周起抗体阳性检出率均为100%,而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好,-20℃保存18个月稳定,与其他病毒参考血清无交叉反应,与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83.3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测,结果,4个猪场阳性率高达90%以上,仅有2个猪场为阴性,其余猪场阳性率为10%~57%。     

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法.敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL.表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测.     

猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞生物学活性的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康仔猪,在接种后不同时间宰杀,收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用FITC-Annexin V/PI双染色流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测PAM凋亡现象,通过EA花环试验测定Fc受体数目,通过吞噬鸡红细胞试验测定吞噬功能,分析PCV2感染对PAM生物学活性的影响。结果显示,在整个试验期内2种方法均没有检测到PAM凋亡,表明PCV2感染不会诱发PAM凋亡。PAM的Fc受体数和吞噬鸡红细胞数的变化规律一致,与对照组相比,两者数量在接种后第3 d明显下降,第7 d有所回升,之后基本恢复,表明PCV2感染后PAM吞噬和清除病原的功能出现短暂下降。     

猪肾虫病的诊断与治疗

20 0 3年春夏间,笔者参加了几次猪病的诊疗,通过临床诊断、治疗效果观察及剖检验证等,最终确诊为猪肾虫病。猪肾虫病是由猪肾虫寄生于猪的肾及其周围脂肪和与输尿管相通的结缔组织的包囊内等处而引起的一种线虫病。猪肾虫又叫有齿冠尾线虫,虫体粗壮、灰褐色,猪只不论大小均可感染,危害较大。患病肥育猪生长迟缓,公猪可失去配种能力,母猪不孕或流产,甚至可造成猪的大批死亡。初期病猪出现皮肤炎症;以后表现为精神欠佳,食欲下降,喜卧,后肢无力,跛行。逐渐贫血,消瘦。检查尿液,如发现虫卵或剖检病猪见肾盂及肾周围脂肪内有虫体,即可确诊。1　诊…     

猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白.     

猪附红细胞体病的诊断与防治

从 2 0 0 2年 8月以来 ,丹东地区发生了一种以高热、发绀、贫血、流产为主要临床症状的猪病 ,其流行面积之大 ,发病猪数之多 ,损失之惨重实属罕见。因多数基层兽医人员对该病认识不清 ,开始被误诊为弓形虫病、钩端螺旋体病、流感、猪瘟、链球菌病、副伤寒等疫病 ,采用青霉素、链霉素、磺胺类药、退热解毒等药物治疗 ,效果均不理想。笔者根据流行病学调查、病理剖检、实验室检查等 ,确诊为猪附红细胞体病。1　流行情况2 0 0 2年 8月 5日 ,在辽宁省东港市菩萨庙镇关海山村首先发现该病 ,接着在宽甸县、凤城市、振安区、振兴区等地的一些乡 (镇…     

猪伪狂犬病和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊治

广东省某猪场饲养母猪 60 0头 ,1999年 8月份初产母猪所产仔猪 3日龄开始发病 ,病猪以发热、尖叫、抽搐为主要特征 ,7日龄时有的整窝死亡。经确诊为伪狂犬病 (ＰＲ)和猪生殖与呼吸综合征 (ＰＲＲＳ)病毒混合感染。1　发病情况该场建于 1997年 8月 ,同年 9月从深圳某种猪场引进种公猪及后备母猪近 40 0头。 1998年 1月配种 ,生产正常。 1999年2月又从深圳某种猪场引进种公猪及后备母猪 2 0 0余头 ,1999年 4月配种。配种前 3 0ｄ左右按免疫程序分别注射了猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪链球菌病、猪细小病毒病、日本乙型脑炎和ＰＲ等疫苗 ,其中ＰＲ…     

PCV2感染对猪MCP-1和IL-8 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间宰杀,收集肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用竞争PCR技术测定趋化性细胞因子IL-8和 MCP-1 mRNA水平,分析PCV2感染对其mRNA表达的影响。结果显示,与对照组相比,在 PCV2感染后第7 d,IL-8 mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至第14 d时达到高峰,而后快速下降,但仍维持较高水平;MCP-1 mRNA水平在攻毒后第3 d下降至最低,之后逐渐上升,至第14 d时达到高峰,而后下降,第21 d以后恢复正常。结果表明,PCV2感染初期可导致PAM趋化性细胞因子IL-8和MCP-1基因的转录明显下调。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪动脉血管内皮细胞上的培养特性

探索应用原代猪血管内皮细胞培养猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究PRRSV对血管内皮细胞的损伤及其作用机制建立模型。用Ⅱ型胶原酶灌注60日龄健康仔猪颈总动脉分离获得动脉血管内皮细胞,以PRRSVHuN4株接种原代猪血管内皮细胞,进行细胞形态和荧光定量RT-PCR检测。结果显示,PRRSV接种原代猪血管内皮细胞后,呈现典型的细胞病变,病毒增殖规律与Marc-145细胞基本相同。结果表明,在猪血管内皮细胞上成功复制了PRRSV,为下一步研究PRRSV在血管内皮细胞中的复制及其导致的病理损伤提供了试验依据。     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

猪细小病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)核苷酸序列,分别设计并合成了3对特异性扩增PPV、PCV2和PRV的引物,扩增片段长度分别为531、466和277bp。经过优化条件,建立了检测PPV、PCV2和PRV的多重PCR方法。采用该PCR方法对23份自然感染病猪样品进行检测,结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果的符合率为100%,同时对临床样品中PPV、PCV2和PRV阳性PCR产物进行测序分析,发现PPV、PCV2和PRV的PCR产物序列与GenBank中公布序列的同源性均达98%以上,证实该多重PCR检测的阳性结果为上述3种病毒。表明,建立的多重PCR方法可用于这3种病毒的临床诊断和流行病学调查。