湖南地区猪圆环病毒2型的分离与鉴定

为分离鉴定湖南地区2个猪场的猪圆环病毒2型(PCV2),从临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪体采集组织病料,验证为PCV2感染的病料,用无污染猪肾细胞系(PK15)细胞分离培养。采用间接免疫荧光试验(IFA)、分子克隆及生物信息学等方法对分离病毒进行分析。结果显示,分别获得了2株PCV2:1株为PCV2d(命名为ChenZ-2-1,GenBank号MH718995),另1株为PCV2b(命名为Yi Y-3-27,GenBank号KU317482),且两分离株的病毒效价TCID50分别为1×10~(5.66)/mL和1×10~(5.5)/mL。本研究有利于提高PCV2的诊断水平,对深入研究PCV2的发病机理及开发PCV2新型疫苗奠定基础。     

断奶猪多系统衰竭综合征的综合防制

猪断奶后多系统衰竭综合征(Post weaningmultisystemicwastingsyndrome ,PMWS)是由致病性猪圆环病毒(猪圆环病毒2型,PCV 2 )引起的一种传染病,一般认为,当PCV 2与其他病原合并感染时,可引起严重的临床反应。该病主要侵害哺乳仔猪和生长育肥猪,以渐进性消瘦和多系统病理损伤为特征,已成为严重危害养猪业的主要传染病之一。2 0 0 3年9～10月,天津蓟县某养猪场的部分断奶仔猪表现渐进性消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、厌食、精神沉郁、腹泻、咳嗽等症状,死亡率较高。10月底该猪场送来5头病死猪、2 0份经产母猪血清、10份发病仔猪血清,要求检验…     

广西断奶仔猪猪圆环病毒2型的检测

对广西 16个养猪场的 2 2份断奶仔猪病料用PCR技术检测猪圆环病毒 2型 (PCV 2 ) ,对阳性病料进一步检测猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及细菌性病原。结果 ,从南宁市郊某猪场表现衰弱症状的病猪病料中检测出PCV 2 ,而这些病料没有检出猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及可疑细菌 ,证实广西存在PCV 2引起的断奶仔猪多系统衰弱综合征 (PMWS)。     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10~2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

猪圆环病毒分离鉴定及猪断奶多系统衰弱综合征的诊断

剖检北京、河北某些猪场发生的仔猪先天性震颤、断奶后发育不良、咳喘、消瘦、黄疸等症状的病猪,均显示猪断奶多系统衰弱综合征(PMWS)的病理学变化;电镜观察病猪的脾和淋巴结组织样品,见细胞核内堆积大量无囊膜的病毒粒子;进而从病猪的病料中分离到2株猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV).经电镜观察细胞内增殖、浓缩、提纯的病毒,为直径约17 nm的无囊膜的病毒粒子;间接免疫荧光试验可观察到PCVⅡ特异性免疫荧光;用2对引物分别扩增分离毒株,均得到2条与PCVⅡ特异性核苷酸片段大小一致的扩增片段.     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

PCV2型和PCV3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速、特异地鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,本研究根据PCV2和PCV3保守区域基因序列,采用Primer Express 6设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针。经过引物筛选和条件优化,建立可鉴别检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR方法。本方法能同时特异性地检测鉴别PCV2和PCV3,且与CSFV、PRV、ASFV、SVDV、FMDV、SVA病毒核酸没有交叉反应。本方法灵敏性强,PCV2和PCV3的最小检出量分别为48.1 copies/μL和58.3 copies/μL。组间和组内试验变异系数不超过1.5％,重复性好。结果表明,本研究创建了一种灵敏度高、特异性强的PCV2和PCV3双重荧光定量PCR方法。     

基于猪圆环病毒2型病毒样颗粒的间接ELISA抗体检测方法的建立

为了建立一种更加安全、可靠的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体检测方法,以实验室前期通过大肠杆菌表达系统获取的PCV2病毒样颗粒(VLPs)为包被抗原,建立了一种间接ELISA方法.用建立的间接ELISA方法检测272份来自不同猪场的血清,并与不同间接ELISA试剂盒的检测结果进行比较.结果 表明,基于PCV2 VLPs的...     

猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增.回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序.结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1 767 bp.应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较.结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99.6%,推导的氨基酸同源性达95.4 %.进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ(EF515839)株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性.