猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增.回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序.结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1 767 bp.应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较.结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99.6%,推导的氨基酸同源性达95.4 %.进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ(EF515839)株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性.     

表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性的研究

为探究表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌口服免疫动物诱导的特异性免疫应答,本研究构建了p MG36e-SLN重组质粒并将其电转化至乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中,制备表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌,经SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定目的基因表达,并将重组菌口服免疫新西兰大白兔,利用间接ELISA方法测定家兔小肠黏膜和血清中抗SLN蛋白特异性Ig G和Ig A。结果显示,表达重组SLN蛋白的重组菌经口服能够有效引起动物体产生较高水平抗SLN蛋白Ig G和一定量的抗SLN蛋白Ig A,表明该重组菌表达系统能刺激动物免疫系统产生应答,具有作为口服疫苗的潜在应用价值。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16 S rRNA基因序列设计了1对引物,分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体,确定特异性产物的Tm值,同时做普通PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为88.5℃,最低能检测到含0.036 fg/μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR,通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化,建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性,为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因的克隆及原核表达

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒F基因序列设计了1对引物,以从水貂犬瘟热病毒中提取的RNA为模板,扩增出一约1 000 bp的F基因片段。将PCR产物按相应的阅读框架克隆到原核表达载体pET-32a中,并将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),用1.0 mmol/L IPTG在30℃下诱导表达。结果显示,F基因的表达量约占细菌总蛋白的35%。SDS-PAGE电泳显示,表达产物的分子质量约为55 ku,与预计大小相符;经Western-blotting试验进一步证实,该基因获得了正确表达。     

猪链球菌2型MRP-FBP串联表达蛋白对小鼠的免疫保护力

针对猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBP)抗原性较强的基因片段,分别设计了1对引物,用PCR扩增出了mrp基因和fbp基因的片段.利用这些片段分别构建了原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-fbp和pET32a-mrp-fbp.将这些表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了表达.SDS-PAGE分析表明,表达的MRP、FBP、MRP-FBP的分子质量分别为47、52、80 ku.Western-blot分析表明,重组蛋白MRP-FBP可被SS2阳性血清所识别.免疫保护试验表明,串联表达的融合蛋白MRP-FBP对BALB/c小鼠的保护率达80%,是目前筛选到的制备SS2亚单位疫苗保护力最高的短片段串联免疫原.     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

弓形虫基因缺失株及其免疫特性研究进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种胞内寄生虫,可以感染多种动物和人.目前,国内外缺乏针对预防弓形虫病的疫苗,传统灭活疫苗和弱毒活疫苗存在保护力差、弱毒返强等缺点.近年来,随着基因敲除技术的不断发展,越来越多刚地弓形虫免疫效果的研究着眼于构建不同基因缺失株,通过比较特定基因缺失的虫株与正常虫株在毒力、...     

热应激对鸡免疫功能影响的研究

在不同热应激处理下分别用新城疫油乳剂灭活苗和Ｎ７９弱毒苗免疫伊莎蛋用雏鸡，各试验组抗体效价和淋巴细胞转化率均有不同程度下降。高温处理２４ｈ的雏鸡，无论用油乳剂灭活苗还是用Ｎ７９弱毒苗免疫，与对照组间无明显差异；高温处理４８ｈ的油乳剂灭活苗免疫组鸡，在免疫初期（免疫后８ｄ）抗体效价和淋巴细胞转化率均下降（Ｐ＜０．０５），以后逐渐上升，与对照组间无明显差异；而Ｎ７９弱毒苗免疫鸡在整个试验期抗体效价明显低于对照组。