预防仔猪大肠杆菌性腹泻MM-3工程菌苗的免疫效果

用MM-3基因工程活菌苗免疫妊娠后期母猪,待分娩后,用BA-ELISA方法检测初乳与新生仔猪血清中的抗K_(88)ac和LT抗体。结果表明,口服或肌注该菌苗均可大幅度提高乳汁及仔猪血清中抗K_(88)ac、LT抗体水平,并使新生仔猪大肠杆菌性腹泻的发病率、死亡率明显降低。     

EgM家族蛋白诱导犬免疫应答动态ELISA检测方法的建立

为建立用重组GST融合EgM家族(EgM9和EgM123)蛋白和GST蛋白免疫的犬血清中由靶蛋白(EgM家族)产生的特异性抗体的检测方法,用GST融合EgM9和EgM123蛋白及GST蛋白为抗原,辅以弗氏佐剂分别免疫试验犬3次,100μg/只,并设GST蛋白组和PBS组为对照。三免后第2周,用羊源原头蚴进行口服感染,25 000枚/只,每周采血直至感染后第45天,以GST融合EgM9和EgM123蛋白包板,用中和反应处理血清中由GST蛋白和大肠杆菌产生的抗体,之后用间接ELISA和Western-blot方法检测血清中IgG、IgM和IgA的水平。结果显示,预处理的犬血清能去除GST蛋白和大肠杆菌诱导的抗体。二免后IgG和IgM水平达到峰值,IgG应答水平随免疫和感染仍能保持高应答水平。三免后IgG应答水平未提高。第三次免疫后IgM应答水平逐渐下降。IgA产生低的免疫应答,随免疫刺激和感染没有显著的变化。结果表明,EgM9和EgM123靶蛋白免疫犬能产生高水平的免疫应答,说明用吸收非特异性抗体监测特异性抗体的方法是可行的。     

不同日龄雏鸡免疫新城疫病毒弱毒疫苗后体液免疫和黏膜免疫反应的变化规律

采用新城疫LaSota弱毒株疫苗经滴鼻、点眼途径免疫不同日龄雏鸡,然后采集血清、泪液和鼻洗脱液,应用血凝抑制试验(HI)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对抗原特异性IgM、IgG和IgA或SIgA抗体水平的消长规律进行检测。结果显示,血清中IgG抗体水平最高,IgA和IgM抗体水平相对较低。免疫组血清HI效价明显高于空白对照组血清HI效价。泪液和鼻洗脱液中新城疫病毒(NDV)特异性IgM出现的最早,于免疫后第4天可检测到,并于第7天达到高峰,而后迅速下降;而NDV特异性IgG、SIgA于免疫后第7天可检测到,并于第21天达到较高水平。13日龄免疫组总抗体水平分别高于6日龄免疫组和3日龄免疫组总抗体水平,但是1日龄免疫组不能诱导呼吸道黏膜产生抗体。研究结果表明,泪液、鼻洗脱液中抗体和血清中抗体均存在日龄相关性变化的特点,为雏鸡出壳后免疫机制的研究和更有效控制新城疫的发生提供了试验依据。     

禽巴氏杆菌免疫鸡IgG、IgM消长规律的研究

本试验利用鸡血清中主要有IgG、IgM(IgA主要在粘膜),和2-基巯乙醇可破坏IgM的理论,以间接血凝法检测禽霍乱731、GNCoⅡ弱毒苗免疫鸡和C_(48-1)强毒接种后发病治愈鸡(即模拟禽霍乱强毒感染鸡)的IgG、IgM消长规律。结果抗体中主要有IgM;当强毒攻击后,三个组均无回忆反应的迹象,其抗体中仍是IgM占优势。对731、GNCo Ⅱ和C(48-1)的荚膜粗提物中多糖与蛋白成分的分析表明,多糖是蛋白的15.35倍以上。荚膜在菌体外层,与机体紧密接触,又为TI抗原,易刺激机体产生IgM,因此产生IgM占优势是巴氏杆菌本身结构块定的。然而如将荚膜抗原与某蛋白载体结合后转变成TD抗原,即可诱导机体产生IgG和回忆反应,这样免疫期可望能延长。目前研制的多种禽霍乱弱毒苗免疫期较短,本试验人工模拟强毒感染康复鸡的免疫期亦较短,从试验结果看出,由于禽霍乱菌免疫主要产生IgM,很少产生IgG,而IgM比IgG消失快的特点及无回忆反应的特点,初步认为是禽霍乱菌免疫期短的原因。     

猪伪狂犬病病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测猪伪狂犬病病毒(PRV)黏膜免疫时特异的IgA抗体的间接ELISA方法,本研究采用PCR方法扩增了PRV gB基因截短片段,并将其连入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建的表达质粒转化至大肠杆菌Transetta(DE3)菌株后,采用IPTG进行诱导表达,得到gB重组蛋白的可溶性表达,并用谷胱甘肽亲和层析柱进行蛋白纯化。以纯化的gB重组蛋白作为包被抗原,以山羊抗猪IgA-HRP为二抗,建立了猪伪狂犬病病毒IgA的间接ELISA检测方法。经ELISA反应条件优化,确定抗原包被浓度为2.4μg/mL,封闭液为10 g/L明胶,一抗37℃孵育1.5 h,二抗1∶20 000稀释后37℃孵育0.5 h,TMB显色液显色10 min。该方法的批内和批间变异系数均小于10%,重复性较好。利用该间接ELISA方法对PRV黏膜免疫的仔猪进行检测,结果可以在鼻腔黏液中检测出特异的IgA抗体。本试验为PRV黏膜免疫提供了初步检测方法。     

猪轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的猪轮状病毒(RV)分别免疫仔猪和兔,制备了猪抗RV和兔抗RV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测RV的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:猪抗RV IgG包被浓度为4 μg/mL,兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5μg/mL,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:8 000,以D<,450nm≥10.161作为阳性判定标准.该ELISA的重复性变异系数小于10 %,最低检测限为1.25μg/mL,并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温和4℃条件下至少可保存4个月.用该ELISA方法和RV金标检测卡检测70份临床粪便样品,结果显示,ELISA的阳性检出率为22.9%,而金标检测卡的阳性检出率为20.0%.表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于RV的快速检测.     

TSOL18抗原重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗对小鼠的免疫保护作用

用构建好的活栽体疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)免疫小鼠,检测小鼠血清中IgG、IgM和肠液中IgA抗体的产生及各免疫组织重组疫苗株的分布情况,分析小鼠脾细胞亚型的分化,探讨了重组疫苗的免疫保护效果.结果显示,在免疫后第7 d,小鼠血清中有抗TSOL18 IgM产生,在二免后第28 d,gG的D492nm值达到0.645,在二免后第42 d,肠液中有抗TSOL18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种方式的免疫应答;小鼠免疫后第21 d在脾中仍能检测到大量的重组疫苗株,表明TSOL18重组蛋白的表达没有影响重组疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)的定居能力;免疫小鼠的CD4 、CD8 T淋巴细胞数目明显增多,D4 /CD8 T细胞比值也显著增高(P＜0.01),提示重组疫苗可能通过提高CD4 /CD8 T细胞比值来发挥免疫作用.     

生物素—亲和素免疫酶标法检测绵羊布氏杆菌抗体的研究

本试验使用生物素——亲和素免疫酶标法(BA-ELISA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对221份绵羊布氏菌病血清抗体进行了检测,同时与常规血清学检测法进行了比较。结果表明BA-ELISA和ELISA的检出率明显高于其它方法。在其中63份菌检阳性和免疫血清中,BA-ELISA和ELISA分别检出60/63份(95.3％)和52/63份(82.5％),而试管凝集试验为20/41份(48.8％),补体结合试验为17/41份(41.5％),虎红平板试验为16/41份(39.0％),此外,还就BA-ELISA法特异性,敏感性等方面进行试验,显示出BA-ELISA具有很强的特异性,其敏感性比ELISA高4～8倍,比常规补体结合反应高256倍。这些都表明BA-ELISA是绵羊布氏菌病血清学诊断上具有发展前途的新方法。     

临产母猪注射大肠杆菌K_(88)-K_(99)抗原工程苗预防仔猪黄痢

1986～1987年,我们用中科院上海植物生理研究所与上海市嘉定县畜牧兽医站共同协作研制的大肠杆菌K_(88)—K_(99)抗原工程苗,在本场东风机械化养猪场、少平村、立新饲养场进行了预防仔猪黄痢试验,获得了一定的效果。 (一)材料和方法 1.大肠杆菌K_(88)—K_(99)抗原工程苗:中科院上海植生所研制,批号860715、870103;20％氢氧化铝生理盐水,农业部南京药械厂生产,批号8596029。     

大肠杆菌多价菌苗的研究

根据我国大肠杆菌常见的血清型44563(O_(8:)K_(87)、K_(88)ac:H_(19))、C83903(O_(141:)K_(89)[B]、K_(88)ab[L])、C83907(O_(149:)K_(91)、K_(88)ac)、44820(O_(101:)K_(99:)H~-)菌株研制成多价灭活口服菌苗和提纯K_(38)粘着素抗原、肠毒素与口服菌苗混合制成的注射菌苗。对母猪行两个途径免疫,其所产仔猪经哺乳后用异种血清型的菌株进行强毒攻击。其结果:第一组(口服-肌肉注射组)新生乳猪发病率为2.5％,保护率为97.5％;第二组(后海穴注射组)发病率为10％,两组均无死亡;未进行免疫的对照组发病率为37％。带有K_(88)粘着素和产毒素能力的异种血清型的C83552菌株进行致病力测定,其结果:口服96～120亿活菌量的新生乳猪发病率为100％,死亡率为100％;口服48亿活菌量的发病率为100％,死亡率为25％。我们选定96亿活菌量作为攻毒的活菌数,进一步扩大试验,以期用于生产。     

应用琼脂双相双扩散法鉴定大肠杆菌菌毛抗原

已知引起仔猪、犊牛、羔羊等幼畜腹泻的肠病原大肠杆菌株,常能产生两种致病因子,即菌毛抗原成分及肠毒素。目前用于临床鉴定分离于这些幼畜腹泻大肠杆菌株是否产生菌毛抗原的方法,主要包括有:抗D-甘露糖血凝反应、直接玻片凝集反应,反向间接血凝反应、酶联免疫吸附试验等。作者本次将琼脂双相双扩散试验用于对K_(88)_、K_(99)、987P、F_(41)菌毛抗原的鉴定,取得了可信性结果,现报告如下:(一)材料1.大肠杆菌株:用于本试验、产生菌毛抗原的4个标准菌株为:①44563,产生菌毛抗原K_(88),血清型分别包括O_8:K_(87),K_(88ac);H_(19),来源于卫生部药品生物制品检定所;②C_(83912),产生菌毛抗原K_(99),血清型别为K_(12),K_(99);③C_(83915),产生菌毛抗原987P,血清型分别为0_9:K_(103),987P:NM;④C_(83919),产生菌毛抗原F_(41),血清型分别为O_(101)∶K_(30),F_(41)∶H~-。后3个标准菌株均来源于中国兽药监察所。用于本试验、从不同动物分离的5株大肠杆菌均不产生K_(88)、K_(99)、987P、F_(41)菌毛抗原,其编号为No.1、No.2、No.3、No.4、No.5,     

大肠杆菌灭能苗预防仔猪黄痢、白痢试验

(一)免疫苗苗 本试验所用的大肠杆菌(K_(88)~+、K_(99)~+)灭能苗,系由湖北省畜牧兽医研究所提供。常温下,本苗可存放1～5个月。 (二)免疫方法 选择品种相同,胎次和预产期相近的正常母猪,随机分为试验、对照两个组。 1.产前母猪免疫(简称母免):对妊娠母猪分别在分娩前15天、7天,及分娩后5天、12天和19天各肌肉注射大肠杆菌苗10～15ml,使初生仔猪通过母乳获得免疫力。 2.仔猪免疫(简称仔免):对未免疫母猪所生仔猪,在出生后2小时以内,吃初乳之前,每头服菌苗1ml。到5、12、19日龄时,每头仔猪再口服2～3ml菌苗。 3.判断标准:用以上两种方法免疫后,仔猪在30日龄内不发生黄、白痢等拉稀现象者     

预防仔猪大肠杆菌性腹泻K_(88)LTB遗传工程苗田间试验

从1985～1990年,笔者试用5批仔猪大肠杆菌K_(88)工程菌活苗在河南、陕西等地的12个猪场进行预防仔猪大肠杆菌性腹泻的免疫效力观察,并对其经济效益进行了测算,效果令人满意。     

大肠杆菌K_(88)抗原分子遗传学研究近况

1961年Φrskov等发现在一次猪腹泻流行中所分离的大肠杆菌含有一种新的K抗原,称K_(88)抗原。K_(88)抗原是一种粘附因子,它使K_(88)阳性菌株附着于肠壁上而不被机体清除。已知K_(88)是一种蛋白质,其基因位于质粒上。以往预防大肠杆菌性腹泻大多采用死菌苗,但效果不够满意,随着分子遗传学及DNA重组技术的迅速发展,可望应用基因工程技术来构建高效、稳定和安全的大肠杆菌苗。     

仔猪大肠杆菌纤毛抗原调查

大肠杆菌纤毛抗原与菌株的肠病原性有着密切的关系。目前已经确认,仔猪致病性大肠杆菌纤毛抗原有4种,即K_(88)、K_(99)、987P和F_(41),它们是蛋白质,不耐热,位于菌体表面,作为一种粘着因素在猪体内发挥作用,使大肠杆菌固着于前部肠道的粘膜绒毛上,产生肠毒素,引起发病。 纤毛抗原免疫母猪,所产生的抗体可通过初乳使仔猪得到被动保护,因而研究纤毛抗原     

母猪初乳乳清IgA和lgG的纯化

IgA和IgG是乳汁中主要的免疫球蛋白。监测乳汁中IgA和IgG水平的变化情况可了解疫苗的免疫效果。我们用分子筛层析、离子交换柱层析等方法从初乳乳清中同时提取IgA和IgG。经免疫电泳及圆盘电泳检测都达到了电泳纯。 (一)材料和方法 1.化学试剂和仪器:葡聚糖凝胶G-25(Pharmacia产品,进口分装),琼脂粉(日本进口分装),OMEGAⅡ70000型超速离心机(西德),751-分光光度计,GZS-O1型紫外吸收分析仪。     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

鸡卵黄新城疫血凝抑制抗体微量法试验

众所周知,在免疲鸡产下的卵内,含有两种抗体,一种是卵黄抗体IgG,来源于母鸡血液中;另一种是卵白抗体IgM和IgA,来源于母鸡输卵管内的分泌液。所以,在1日龄雏鸡体内,含有IgG、IgM和IgA3类抗体,统称为母源抗体。其中,血液中的母源抗体量,可以通过血清HI试验测知,也可以通过卵黄HI试验来估量。据大量试验资料证明,卵黄HI抗体量,与母鸡血清HI抗体量相一致,而稍高于1日龄雏鸡血清HI抗体量。所以,只要检测卵黄样HI抗体量,就可以了解母鸡群的免疫状态和雏鸡母源抗体水平。检测卵黄抗体的方法,有试管法和微量法两种,其中试管法所用卵黄样较多,试验液总量大,混浊度也较大,吸取卵黄样所用的吸管内壁粘附了     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

毒害艾美耳球虫感染雏鸡消化道的局部免疫变化

将120只14日龄雏鸡随机分为毒害艾美耳球虫感染组和未感染球虫对照组,应用间接ELISA及免疫酶组织化学染色法对相关免疫指标进行了检测,以研究毒害艾美耳球虫感染对雏鸡消化道局部免疫功能变化的影响。结果显示,毒害艾美耳球虫感染雏鸡后7～21d,其肠液、胆汁中的IgA、IgM、IgG含量和盲肠扁桃体中抗体生成细胞的数量均不同程度高于对照雏鸡。表明毒害艾美耳球虫感染雏鸡后,在一定时间内其消化道局部的体液免疫功能明显提高。