长江中下游地区规模化猪场猪繁殖障碍性疾病的病原学检测

应用PCR与RT-PCR方法,检测了127份来自于长江中下游地区7省市24个规模化猪场患繁殖障碍的病猪的病料,检测病原包括猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及日本脑炎病毒(JEV).结果显示,在上述127份样品中,有10份样品为PRRSV单独感染,占检测样品数的7.87%,有54份样品为PRRSV与PPV混合感染,占样品总数的42.52%,有50份样品为PRRSV与PCV-2混合感染,占样品总数的39.37%;有15份样品为PRRSV与PRV混合感染,占样品总数的11.81%;有8份样品为PRRSV与JEV混合感染,阳性率为6.30%;有18份样品为PRRSV与CSFV混合感染,占样品总数的14.17%.提示,长江中下游地区规模化猪场的猪群普遍存在PRRSV与PPV、PCV-2、JEV及PRV的混合感染.     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

用于诊断4种猪病毒病的寡核苷酸芯片的研制

制备可同时检测引起集约化养猪业常见4种传染病,病毒(猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳)的寡核苷酸芯片。根据4种猪疫病病毒特异性基因的保守区域设计合成了60 mer寡核苷酸探针,制备寡核苷酸芯片。采用不对称PCR和间接荧光标记技术进行单链DNA扩增和荧光标记,标记样品与寡核苷酸芯片杂交后,进行芯片清洗、扫描及结果分析。杂交结果显示,4种病毒的寡核苷酸检测探针均特异地与相应的标记样品杂交,芯片上呈现较强的阳性杂交信号,而除阳性质控探针外,阴性对照和空白对照均检测不到荧光信号。证明寡核苷酸芯片适用于快速、准确、高通量地诊断影响集约化养猪业的多种猪疫病病毒。     

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法.敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL.表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测.     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光LAMP检测方法的建立

本研究为建立一种检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的二重荧光(LAMP)技术,根据已发表的CSFV E2基因和PRRSV NSP2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PRRSV序列的特异性引物和2条探针,在CSFV探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PRRSV探针5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。用设计的引物、探针及反应试剂组成反应体系,建立CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法。对建立的方法进行特异性、敏感性、干扰性试验,并用临床样品进行验证。结果显示,本研究成功建立了鉴别CSFV和PRRSV的二重荧光LAMP方法,该方法只检测出CSFV(绿色)或PRRSV(红色)或CSFV和PRRSV混感(黄色),而对照毒株则无荧光颜色出现,具有较好的特异性。敏感性检测CSFV或PRRSV的含量浓度,其最低检测浓度均为100 copies/mL,敏感性较好。干扰性结果显示,高低不同的模板浓度不影响本方法的检测扩增,干扰性小。对112份采集的临床样品进行检测,结果,检出CSFV阳性样品41份,PRRSV阳性样品12份,CSFV和PRRSV同时为阳性的样品3份,该结果与荧光定量RT-PCR方法的检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,并具有检测临床样品中CSFV和PRRSV的潜力。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒二联基因芯片的构建与应用

针对靶基因库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组质粒T/PRRS-PS9、T/Y11和日本脑炎病毒(JEV)的重组质粒T/PRM/M、T/JEV-C,设计4对特异性引物,采用PCR扩增获得4个靶基因片段,并用PCR标记Cy3探针,建立了一种检测PRRSV和JEV的芯片方法。特异性试验结果显示,PRRSV、JEV之间无交叉杂交,猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒与PRRSV-JEV基因芯片无杂交反应。灵敏性试验结果显示,50μL杂交体系中探针DNA的质量浓度为0.295pg/μL时仍为杂交阳性。对从猪场收集的31份样品进行处理并用基因芯片检测,PRRSV的检出率为12.9%(4/31),JEV的检出率为9.68%(3/31),PRRSV与JEV混合感染的检出率为0(0/31)。此方法的结果与PCR的检测结果完全符合。结果表明,所建立的二联基因芯片有望成为一种快速鉴别PRRSV与JEV的新方法。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

一种新型同时检测6种猪病毒病简化靶序列富集多重PCR的建立和初步应用

为建立一种新型同时检测6种猪常见病的方法,针对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的保守基因,设计6对特异引物,在引物的5′端加上一段非同源性标签序列,再设计1对可识别标签序列的超级引物。通过优化反应条件,建立了6种猪常见病毒的简化靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)检测方法。灵敏度试验结果显示,该方法对PRV、JEV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV核酸的最低检测限度分别为4.36×103、2.21×103、2.69×103、3.18×103、2.63×104、3.12×104copies/L,而单重PCR检测的最低限度分别为1.3×101、2.59×102、8.03×101、3.29×101、2.65×101、2.45×102copies/L。该方法对54份临床样本的检测结果与国标单重PCR检测结果的一致性为94.9%。本试验建立的方法特异、灵敏、操作简便且成本低廉,对这6种猪病常见病原的同时检测有一定的参考意义。     

江苏省猪高热病病例主要继发感染病毒的多重PCR检测

应用建立的2个多重PCR方法,对2005~2006年收集于江苏省的211份猪高热病疑似病料进行了检测。结果,PRRSV阳性率为51.2%,PCV2阳性率为44.1%,CSFV阳性率为10.4%,PPV阳性率为3.9%,PRV阳性率为2.4%。2005年病料中PCV2阳性率为21.2%,2006年为73.2%;2005年PRRSV阳性率为38.1%,2006年为67.7%。2006年猪高热病疫情比2005年严重,PCV2和PRRSV可能在其中发挥了协同致病作用。对10个PRRSV分离株ORF5基因和Nsp2基因进行的测序表明,2006年分离株Nsp2基因中有连续87个碱基的缺失。     

猪输血性传播病毒2型全基因组的克隆与序列分析

为了监测猪输血性传播病毒2型(TTV2)的疫源和进化情况,为进一步研究TTV2的形态结构、遗传变异和基因功能奠定生物学基础,参照国外发表的猪输血性传播病毒(TTV)全基因组核苷酸序列(GU456386.1),设计3对特异性引物,采用巢式PCR对采自四川省的疑似猪输血性传播病毒感染的血清样品进行TTV全基因组的克隆、测序和拼接,并对其进行同源性分析和遗传进化分析。结果显示,该基因组全长2 802bp,与国内外参考株同源性介于87%～96%之间,ORF1的同源性介于81%～95%;ORF2的同源性较高,介于93%～99%之间。系统进化树分析表明,该分离株与美国株PTTV2c-VA的同源性高达96%。结果表明,该毒株为TTV2,与国内外参考株有一定的相似性。     

云南省红河州猪繁殖障碍综合征的流行病学调查

针对云南省红河州猪繁殖障碍综合征严重危害养猪业的情况,对全州12个县(市)21个种猪场982户农户的4 329头繁殖母猪和种公猪进行了流行病学调查。结果表明,猪繁殖障碍综合征发病率在种公猪为23．6％,妊娠母猪为40．6％．初生仔猪死亡率为18．6％;在死亡仔猪中,流产占10．1％,死胎占54．5％,弱仔占32．5％,畸形占2．9％。初步查清了引起红河州猪繁殖障碍综合征的主要病原有细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、衣原体(Chlamydia)、乙型脑炎病毒 (JEV)、刚地弓形虫(TG)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、圆环病毒2型(PCV2)、布鲁氏菌 (Bruc)和猪瘟病毒(CSFV)等9种,其中CSFV的带毒率为1．1％,其他病原的血清抗体阳性率分别为PPV 27．7％,PRV 24．6％,衣原体22．8％,JEV 13．6％,TG 12．0％,PRRSV 11．5％,PCV2 7．2％,Bruc 4．6％,总阳性率达75．4％,其中单一病原抗体阳性率为39．6％,两种和两种以上病原抗体阳性率为35．6％。     

猪流行性腹泻病毒SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102～4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%～0.87%,组间变异系数为0.32%～1.24%,重复性好。结果表明,建立的SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法.用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应.该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验.用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%.另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%.表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重.