鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3''''端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因(F基固)cDNA序列,设计并合成了1对引物,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的核酸(RNA)为模板,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对其融合蛋白基因3'端进行扩增,获得了预计的884 bp左右的片段.将该片段克隆进pGEM-T Easy质粒载体,获得重组质粒T-GPMVF3',采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定,证明所克隆的片段即为目的基因片段,这为进一步开展鹅Ⅰ型禽副粘病毒的分子生物学研究奠定了基础.     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3′端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因 (F基固 )cDNA序列 ,设计并合成了 1对引物 ,以分离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97 1株的核酸 (RNA)为模板 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)对其融合蛋白基因 3′端进行扩增 ,获得了预计的 884bp左右的片段。将该片段克隆进 pGEM TEasy质粒载体 ,获得重组质粒T GPMVF3′ ,采用限制性内切酶和PCR方法对该重组质粒进行鉴定 ,证明所克隆的片段即为目的基因片段 ,这为进一步开展鹅Ⅰ型禽副粘病毒的分子生物学研究奠定了基础     

四株广东鸽源新城疫病毒的生物学特性

采用RT-PCR方法从广东省分离的4株鸽新城疫病毒中扩增出F和HN基因片段,并对其进行克隆及序列分析,另外对该4株分离株进行了致病指数的测定。结果发现,分离株NDV/GD-1的静脉接种致病指数为1.84,脑内接种致病指数为1.287 5,鸡胚平均死亡时间为78h;NDV/GD-2的静脉接种致病指数为1.55,脑内接种致病指数为1.162 5,鸡胚平均死亡时间为138h;NDV/GD-3的静脉接种致病指数为0.44,脑内接种致病指数为1.35,鸡胚平均死亡时间为126h;NDV/GD-4的静脉接种致病指数为2.51,脑内接种致病指数为1.35,鸡胚平均死亡时间为84h;分离株NDV/GD-2属于基因Ⅱ型;NDV/GD-4属于基因Ⅶd型,与广西株Gxp40亲缘关系最近;NDV/GD-1、NDV/GD-3均属于基因Ⅵ型,与云南分离株Pigeon/China/YN亲缘关系最近;比较分离株与流行的新城疫基因Ⅶ型毒株的F全基因序列以及分离株与常用疫苗株的F、HN全基因序列,发现核苷酸和氨基酸差异较大,证实这4株分离株的生物学特性均有不同程度的差异。     

鸽Ⅰ型副粘病毒的分离和鉴定

用分离的对鸽有致病性的4株禽副粘病毒通过电镜观察、病毒中和试验和动物回归试验结果显示,病毒粒子呈球形,直径100～450 nm,表面有纤突;能凝集鸡红细胞,血凝反应能被新城疫病毒(NDV)和鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-1)阳性血清所抑制;接种1月龄乳鸽能使其发病,出现明显症状和病变并有死亡,接种1月龄SPF鸡不发病;能在鸡胚成纤维细胞(CEFs)上生长,并能产生细胞病变(CPE);对高温敏感,在55℃放置60 min基本上无感染力;对乙醚、胰酶和酸(pH4.0)等敏感,二价镁离子对其有保护作用;各毒株均能产生蚀斑,蚀斑为浅灰色,形态较规则,清晰透明,直径2.0～4.5 mm.根据以上特性鉴定为PPMV-1,其中ZQ98-1及SZ98-1为中强毒力毒株,ZJ98-1及DG98-1为较弱毒力毒株.采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ZQ98-1株F基因全长cDNA,经全自动测序,获得了ZQ98-1株F基因全序列,进一步从分子水平证明4株分离毒株为PPMV-1.     

应用反转录-聚合酶链反应检测鸽Ⅰ型副粘病毒的研究

根据鸡新城疫病毒(NDV)和鸽Ⅰ型副粘病毒F基因的保守序列,设计合成1对引物XZ9、XZ10,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对3株鸽Ⅰ型副粘病毒和6种其它禽病原体进行检测.结果,该引物对3株鸽Ⅰ型副粘病毒均扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物,而对鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、大肠埃希氏菌、禽腺病毒、禽巴氏杆菌扩增结果均为阴性;RT-PCR最低能检出1pg的鸽Ⅰ型副粘病毒的核酸模板.     

一株新的鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒的分离鉴定

从进口鸽中分离到1株鸽Ⅰ型副黏病毒,经测定,其鸡胚平均死亡时间(MDT)为59．2 h,鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1．92,属于速发型新城疫病毒。通过RT-PCR,扩增出了该分离毒株F基因的重要功能区片段,经测序分析,其裂解位点的氨基酸序列为112RRQKR117F,符合新城疫强毒裂解位点特征。用blastn和blastx分别搜索GenBank的核酸和蛋白数据库,发现它与2株鸽Ⅰ型副黏病毒具有99％的同源性,系统发育进化树分析为基因Ⅵ型。表明,该病毒为1株新的强毒力鸽源基因Ⅵ型新城疫病毒。     

我国部分地区新城疫病毒分子流行病学研究

将来自江苏、浙江、上海、福建、江西和新疆6省(市、自治区)的10株新城疫病毒(NDV)分离株经克隆纯化,用反转录PCR扩增其F基因9×102bp片段,测定序列,通过与国内外已发表的NDV F基因部分序列进行比较,测定的10个分离株分别属于Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ3个基因型.其中近年流行的基因Ⅲ型病毒与同属于该型的经典强毒F48E8的同源性较低,约为92%;明显小于近年流行的基因Ⅲ型毒株之间的同源性(＞99%);近年分离的NDVⅥ型毒株之间的同源性和Ⅶ型NDV毒株之间的同源性为92%-96%.从各毒株的分离时间来看,新基因型NDV毒株不断出现,而原有的NDV强毒也能分离到.     

鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其生物学特性的研究

为了探索湖北省黄冈市某鸡场在2016年9月自然发病的大批量鸡死亡的原因,为临床诊断新城疫病毒感染提供病理学依据。采集病死鸡的组织样品,经9日龄SPF鸡胚接种传代分离病毒后,利用HA和HI试验、RT-PCR扩增F基因,对分离株进行鉴定,并通过测定鸡胚最小致死剂量的平均死亡时间、1日龄雏鸡脑内接种指数及组织病理学观察评估分离株的毒力和致病性。结果,从送检的病死鸡中分离到1株NDV,命名为Chicken-China-Hubei0901-2016,简称HB0901。HB0901株F基因裂解区域氨基酸序列为112R-RQ-K-R-F117,符合强毒株特征。HB0901株与F17株同处于基因Ⅶ型分支上,其核苷酸序列同源性高达99.4%。该分离株的MDT和ICPI分别为47.8 h和1.96。显微镜下可见新城疫典型的组织病理学变化。结果表明,基因Ⅶ型新城疫毒株是导致该批鸡大量发病死亡的原因。     

不同序列型禽白念珠菌对鸡致病性的研究

为了探究不同禽类来源和序列型(STs)的白念珠菌菌株对鸡致病力的差异,以禽源白念珠菌多位点序列分型(MLST)中三个主要克隆群Group 25、Group 26和Group 34的发源序列型(founders)ST 3221、ST 3164和ST 3226的代表株BDK7、RZ-1和BYCSF为试验菌株,分别采用嗉囊注射和颈静脉注射接种途径感染蛋雏鸡,通过观察临床症状、剖检病变、组织病理学变化和生存统计分析,比较试验菌株对鸡致病力的差异。三个试验菌株均可对蛋雏鸡致病,侵染的主要靶器官是肝脏和脾脏;嗉囊接种组鸡的总死亡率仅9.3%(7/75),远小于静脉接种组鸡的总死亡率61.3%(46/75);从试验菌株致病力的比较来看,嗉囊接种组和静脉接种组的致病力排序分别为RZ-1BDK7BYCSF和BDK7RZ-1BYCSF。研究结果表明,不同禽类来源的白念珠菌试验菌株均可使蛋雏鸡致病;不同基因型菌株间的致病力差异显著;当感染途径不同时各试验菌株表现出的相对毒力也明显不同。     

黑龙江省和河北省鸡新城疫病毒分离株的遗传变异分析

利用 RT PCR 技术扩增出了 4 株 NDV 分离株(HeB 4 99, HeB 5 99、HeB 6 02 和HLJ 10 02)F基因539 bp的片段,将该片段克隆到 pMD 18 T载体上。经酶切分析、质粒 PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得了4株 NDV分离株 F基因部分片段的重组质粒。同源性分析显示,4株分离毒株的核苷酸序列具有 95.9%~100%的同源性,与 LaSota的核苷酸序列同源性为81.0%~81.8%,与F48E9的核苷酸序列同源性达85.8%~89.3%。推导氨基酸序列分析表明,4个毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112RRQKRF117,具有强毒株裂解位点氨基酸组成特点,与ICPI和MDT测定结果相吻合。73株NDV毒株的系统发育进化树分析表明,HeB 4 99、HeB 5 99、HeB 6 02和HLJ 10 02均归属于基因Ⅶ型。