口蹄疫病毒3B基因的高效表达及其表达产物的反应活性

通过PCR技术获得口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因,将其克隆至质粒pET-32a( )和高效可溶性表达质粒pEM中,经PCR筛选,获得阳性重组子pET-3B和pEM-3B,将它们转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot检测结果证明,表达的3B融合蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。蛋白可溶性分析表明,EM-3B融合蛋白绝大部分以可溶形式表达。以此可溶性融合蛋白EM-3B为抗原建立了可区分FMD免疫动物和感染动物的EM-3B-DIVA-ELISA方法,经检测,其特异性为95.0%,敏感性为97.5%,与2个国产试剂盒的符合率分别为96.25%和98.75%。     

广西黄鸡β-防御素Gal-4基因的克隆和体内诱导表达

采用RT-PCR方法从广西黄鸡骨髓中扩增了β-防御素Gal-4基因的cDNA片段。序列分析结果表明,获得的广西黄鸡Gal-4基因大小为321 bp,推导的Gal-4由63个氨基酸组成,其中N端20个氨基酸为信号肽,C端38个氨基酸组成Gal-4的成熟肽。另外,分析了Gal-4基因在正常广西黄鸡(对照组)和H9N2禽流感病毒感染的广西黄鸡(感染组)的肺、肝、腔上囊、十二指肠、肾、气管组织中的表达情况。分析结果表明,在检测的6个组织中,肺、十二指肠、肾组织Gal-4基因的表达在感染组和对照组之间没有明显的差别,而在肝、气管和腔上囊组织中的表达有明显差异,感染组比对照组的Gal-4阳性样品数多。在肝组织中,对照组的30个样品检测到26个阳性样品,而感染组的30个样品全都是阳性；在气管组织中,对照组30个样品检测到19个阳性样品,而感染组的30个样品检测到24个阳性样品；在腔上囊组织中,Gal-4基因的诱导表达情况非常明显,对照组30个样品中仅有9个阳性,而感染组的30个样品中有21个阳性。     

鸽Ⅰ型副粘病毒的分离和鉴定

用分离的对鸽有致病性的4株禽副粘病毒通过电镜观察、病毒中和试验和动物回归试验结果显示,病毒粒子呈球形,直径100～450 nm,表面有纤突;能凝集鸡红细胞,血凝反应能被新城疫病毒(NDV)和鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-1)阳性血清所抑制;接种1月龄乳鸽能使其发病,出现明显症状和病变并有死亡,接种1月龄SPF鸡不发病;能在鸡胚成纤维细胞(CEFs)上生长,并能产生细胞病变(CPE);对高温敏感,在55℃放置60 min基本上无感染力;对乙醚、胰酶和酸(pH4.0)等敏感,二价镁离子对其有保护作用;各毒株均能产生蚀斑,蚀斑为浅灰色,形态较规则,清晰透明,直径2.0～4.5 mm.根据以上特性鉴定为PPMV-1,其中ZQ98-1及SZ98-1为中强毒力毒株,ZJ98-1及DG98-1为较弱毒力毒株.采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),扩增出ZQ98-1株F基因全长cDNA,经全自动测序,获得了ZQ98-1株F基因全序列,进一步从分子水平证明4株分离毒株为PPMV-1.     

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板,扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株3-1E基因(长度为529 bp),将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中,构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母,甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测,表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

口蹄疫病毒3C蛋白酶的T4噬菌体表面展示

对FMDV 3C基因克隆质粒p3C-T进行PCR扩增,获得了口蹄疫病毒3C蛋白酶基因片段,将此片段与T4噬菌体整合质粒pR的EcoRⅠ酶切片段连接,转化E．coli,DH5α工程菌,经EcoRⅠ酶切、质粒PCR扩增、插入方向筛选及测序鉴定,成功获得了T4噬菌体重组整合质粒pR- 3C。将其转化E．coli E2后,与SOC基因缺失的噬菌体φT4-Z1同源重组,经溶菌酶依赖性筛选,获得了快速溶菌型噬菌体φT4-3C。经噬菌体PCR扩增、SDS-PAGE分析和Western-bot分析,重组噬菌体可展示约26 ku的重组蛋白;其大小与预期相符,具有免疫原性。     

霍乱弧菌封闭带毒素功能片段△G的原核表达及其免疫增强活性

用PCR扩增了MBP-ZOT质粒上的ZOT基因,该基因编码264~399位氨基酸残基C末端的15kuΔG片段,并与经改造后的质粒PBCX连接。将重组后的质粒PBCX-ΔG在大肠杆菌BL21中表达,将表达的目的蛋白纯化,再将PBCX-ΔG片段与传染性腔上囊炎病毒VP2包涵体蛋白通过滴鼻免疫途径对14日龄SPF鸡进行联合免疫试验,分别于免疫后第102、0 d采集血清样品,进行ELISA试验,检测免疫后IBD抗体效价。动物免疫试验发现:融合蛋白PBCX-ΔG起到了明显免疫增强效果,与VP2重组蛋白联合免疫2次后,血清IBD的VP2 IgG抗体效价是单独用VP2免疫组的3倍,明显高于空白免疫组。     

以免疫活性串联片段FB为抗原检测FMDV抗体的间接ELISA方法

将口蹄疫病毒免疫串联片段FB克隆至原核表达载体pBAD/TOPO中,得到重组质粒pBAD-FB,将此重组质粒转化到受体菌TOP10中,以不同浓度的阿拉伯醛糖进行诱导,并在不同诱导时间进行采样,经处理后做SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果发现以终浓度为0.02g/L的阿拉伯醛糖进行诱导,4h后表达量可达高峰,其大小约为26ku,扫描结果显示,FB融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的28.9%,能与抗FMDV抗体发生特异性反应,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。将融合蛋白的可溶性组分用500g/LNi-NTA树脂过柱纯化后作为包被抗原,成功地建立了检测血清中FMD抗体的间接ELISA方法。融合蛋白的最佳包被浓度是40μg/mL;标准阳性血清的最适稀释倍数为1∶160;最佳封闭液为50g/L脱脂奶粉和PBS;最佳封闭时间为1h。用建立的ELISA方法对采集的118份样品进行检测,并与全病毒包被抗原ELISA、间接血凝诊断试剂盒和UBIVP1抗体检测ELISA试验盒的检测结果比较,证明所建立的方法具有良好的特异性、敏感性和可重复性。     

H1N1亚型猪流感病毒HA基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法扩增了H1N1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的血凝素(HA)基因,测序后对HA基因进行了生物信息学分析。将HA基因克隆到高效可溶表达载体pBCX上,成功构建重组表达质粒pBCX-HA。将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达。诱导表达的HA融合蛋白分子质量约为94.0 ku,表达产物占菌体总蛋白的29.5%。经Western-blot分析证实可溶表达的融合蛋白与H1N1亚型猪流感病毒阳性血清具有良好的免疫反应性。用纯化的HA融合蛋白作包被抗原用于猪流感病毒单克隆抗体的筛选,成功筛选到2株针对HA蛋白抗原表位的单克隆抗体;ELISA结果表明,制备的SIV单克隆抗体ⅢF6A4C10与H1N1亚型SIV抗原具有特异的免疫反应性,为H1N1 SIV的鉴别诊断奠定了基础。