环形泰勒焦虫裂殖体细胞培养及其免疫原性的研究

环形泰勒焦虫(Theileria annulata)病是对牛危害较大的一种血液寄生虫病。虫体经缺缘璃眼蜱(Hyalomma detritum)传播给牛体后,在肝脏、脾脏和淋巴结内发育成裂殖体(schizont),即柯霍氏小体(Koch's bodies),然后侵入红细胞形成配子体(gameto-cyte),可引起牛只严重发病,甚至死亡。裂殖体具有很强的病原性和免疫原性,目前,通过细胞培养方法,已能使裂殖体长期地在体外生长,为进一步研究虫体的生长繁殖特性和环形泰勒焦虫病的疫苗免疫,提供了可能。     

环形泰勒焦虫(Theileria annulata)裂殖体细胞培养的研究

牛环形泰勒焦虫病为我国北方地区危害较大的一种血液寄生虫病,裂殖体(Schizont)或柯霍氏小体(Kochs bodies)是泰勒焦虫在网状内皮系统发育阶段的一种形态,主要寄生在肝脏,脾脏和淋巴结的网状细胞和成淋巴细胞内,具有很强的病原性和免疫原性。目前,通过细胞培养的方法,已能使裂殖体连续不断地在体外繁殖。     

牛环形泰勒焦虫同牛瑟氏泰勒焦虫交叉免疫的研究

近年来,我国研制成功的牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,用其作为抗原物质,注射易感牛体后,可刺激有机体产生抗环形泰勒焦虫病的保护性抗体,并能有效地预防牛环形泰勒焦虫病。这已经通过试验和在生产中大批推广应用后,取得明显免疫效果而证实,然而这种具有特异性的免疫反应和保护效能,仅在预防环形泰勒焦虫病中发挥着应有的作用。但对于免疫泰勒属中的其他种(牛瑟氏泰勒焦虫)能否起到良好的安全保护作用,目前在国内外尚未见报道。因此我们考虑在家畜原虫学的免疫中,在同属异种中通过一种虫苗,能在同     

牛泰勒焦虫病人工免疫的研究

在无产阶级文化大革命的推动下,我们于1967、1969和1970年在宁夏地区,对危害牛只较大的寄生虫病之一——牛环形泰勒焦虫病进行了人工免疫试验。经过三年的试验证明,裂殖体疫苗具有明显的免疫能力,并能保护被接苗牛安全渡过泰勒焦虫病流行季节,从而给牛泰勒焦虫病的防制工作,提供了一个新的途径。     

寄生牛环形泰勒焦虫裂殖体的淋巴细胞冻存液的研究

牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,是我国血孢子虫免疫方面的第一个活虫苗,并已大面积应用于牛环形泰勒焦虫病流行区。我们于1977年试验成功了用液氮(-196℃)冻存含裂殖体牛淋巴细胞,为工厂化大量制苗提供了种子细胞,但种子细胞在液氮内冻存的过程中,也有程度不同的死亡,所以研究如何延长含裂殖体细胞苗的存活时间和提高种子细胞在掖氮中(-196℃)冻存后的存活率,是目前急待解决的问题。1985年我们曾用鱼鳞明胶和     

牛瑟氏泰勒焦虫和环形泰勒焦虫液氮保存试验

低温保存家畜寄生原虫,国外多有报道。关于环形泰勒焦虫(Theileria anulata)的低温保存,B.T.(1973)证实用液氮保存环形泰勒焦虫495天仍存活。等(1975)认为环形泰勒焦虫裂殖体,以10～15％的甘油作保护剂,用干冰先冷却到-70℃后入液氮,保存120天仍有活力。国内仅张中行等(1980)作了人工培养的环     

环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白的亚细胞定位分析

为研究微线体-棒状体蛋白在环形泰勒虫裂殖体及其在感染环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞中表达情况及亚细胞定位,应用Western-blot验证了该蛋白多克隆抗体的特异性;通过条件摸索找出最佳比例的固定剂和最佳一抗、二抗的工作浓度;利用优化好的条件对微线体-棒状体蛋白进行间接免疫荧光试验,用激光共聚焦技术确定该蛋白在环形泰勒虫裂殖体和其在感染的淋巴细胞中表达及亚细胞定位。结果表明,微线体-棒状体蛋白主要定位于环形泰勒虫裂殖体的表面,而在宿主淋巴细胞细胞质中分布较少。     

牛羊边虫和焦虫的冷冻保存试验

为便于人工感染和制作诊断抗原,笔者对牛的大巴贝西虫(Babesia major)、双芽巴贝西虫(B.bjgemina)、环形泰勒焦虫(Thcileria annulata)、环形泰勒裂殖体(Schizont)、牛边缘边虫(Anaplasma mairginale)和绵羊边虫(A.ovis)进行了超低温冷藏试验,获得了满意的结果     

牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗免疫效果的观察

1985年3月,我们在陕西省的凤翔、雁塔、未央、韩城、旬邑、延安、蒲城等县(区)29个乡镇,7个奶牛场,102个村应用由中国农业科学院兰州兽医研究所和宁夏畜牧兽医研究所共同研制的牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗进行了免疫安全性试验和扩大试验,为推广应用本虫苗提供了资料。 (一)材料和方法 1.虫苗:为宁夏畜牧兽医研究所制造的第33、39代8534、8548等批号的牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,置4℃冰箱或冰壶保存。注苗时,将本虫苗于40℃溶化、稀释,当日用完,一牛一针。对虫苗镜下计数:107万个活细胞/毫升细胞苗。     

牛环形泰勒焦虫补反抗体测定

据资料报道,补体结合反应(CF)是动物和人感染原虫后出现的一种比较特异性的血清学反应。 ( 1966)用环形泰勒焦虫红细胞型虫体作抗原。检测了实验感染环形泰勒焦虫牛的补反抗体,对补反阳性牛进行攻蜱试验,结果表明阳性牛具有对该病的免疫力。P.Hooshmand-Rad等(1971)利用环形泰勒焦虫组织培养物作抗原成功地测定了牛体注苗后血液中的补反抗体。关于这方面的资料国内尚未见报道。本实验以人工培养     

含环形泰勒焦虫裂殖体细胞的转瓶培养效果

自从Tsur氏1945年用血浆凝块法培养环形泰勒焦虫感染牛的脾脏或淋巴结碎片,首次将环形泰勒焦虫裂殖体在体外培养成功后,Tsur氏和他的同事随后对培养方法不断加以改进,用膨酶消化单层细胞培养法代替了血浆凝块法,使裂殖体的人工培养前进了一大步,为近年来扁瓶静止培养法大量培养含裂殖体细胞打下了基础。由于动物细胞在玻瓶内培养要经过贴壁繁殖的过程,因此充分利用瓶壁面积,使细胞尽量多地得到贴壁机会,是提高细胞增     

间接血凝法诊断牛环形泰勒焦虫病

传统的镜检诊断牛环形泰勒焦虫病对隐性感染,轻度带虫和缺乏配子体的感染诊断困难,而且受到制片与染色技术等多种因素的影响。易造成漏诊和误诊,特别是对大规模的流行病学调查及相似形态虫体的鉴别诊断上更为困难。我们应用间接血凝(Lndirect haema-glutirotion INA)试验诊断牛环形泰勒焦虫病,效果令人满意。并能揭示患病动物的抗体和虫体的消长情况及其相互关系。     

家畜常见寄生性原虫体外培养的研究概况

当前,组织培养技术作为一种新的研究手段已应用于家畜寄生虫病的研究领域,尤其在原虫病的研究中起到了积极的作用。 自Gavribov等(1938)报道了乌疟原虫(plasmodium capisfrauni)红外期体外培养以来,Tsur(1945)进行了牛环形泰勒焦虫(Theileria annulata)裂殖体在离体组织中生长繁殖的研究。Hulliger等(1964)用分散细胞单层来大量繁殖Tannulata裂殖体。patton(1965)在初代牛肾细胞上观察了脆弱艾美尔球虫(Eimeria tenella)无性期的发育。Dorna(1970)在细胞培养中观察到了鸡球虫完整的生活史。然而组织培养中原虫的培     

牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t的体内扩繁试验

以被去除脾的昆明小白鼠为实验动物(40只),接种牛源环形泰勒虫吐鲁番流行株Ta-t,进行小鼠体内扩繁试验,并于接种后第8、12、24、48小时以及第3~10天每天经血液涂片检查接种后昆明小白鼠的红细胞染虫率,观察分析其扩繁情况;经昆明小白鼠心脏、眼球采血的方法收集其最高染虫率(15%以上)的血液内裂殖子,并进行冻存,摸索其保存、复苏条件等。结果显示,除脾术后昆明小白鼠均存活,检测其呼吸、脉搏、食欲、精神状态皆良好,说明摘脾手术成功;接种后第48小时可在昆明小白鼠血液里观察到裂殖子,第5~9天每组昆明小白鼠的平均染虫率可达15%~20%(最高峰),第10天后染虫率开始下降,血液涂片中裂殖子数量渐渐减少;经试验发现,在雌雄性昆明小白鼠体内的染虫率差异极显著(P=0.0070.01),去脾昆明小白鼠与未去脾昆明小白鼠的染虫率差异也极显著(P=0.000 20.01),牛源环形泰勒虫在除脾的昆明小白鼠血液内能被置换、增殖。染虫率为15%以上时昆明小白鼠血液里的裂殖子可用冷冻(-80℃)保存,亦可制作玻片裂殖子抗原备用,保存半年以内的裂殖子复苏活性最佳。该试验数据可为建立环形泰勒虫动物模型、教学、科研提供丰富的血液原虫株资源。     

日本血吸虫保护性免疫机制的研究——体液免疫应答

本文应用辐照致弱日本血吸虫童虫疫苗、冷冻辐照致弱童虫苗和速冻致死童虫苗免疫雌性C_(57)BL/6小鼠,免疫后检测体液免疫应答动态变化。结果及相关分析表明抗膜抗体和依赖补体的抗体杀伤作用在抗血吸虫感染中起到一定作用,而抗可溶性抗原抗体和脾脏中B淋巴细胞百分数与保护力之间缺乏相关性。     

羊泰勒虫中国株裂殖子的蛋白分析

采用SDSPAGE和Westernblotting试验对羊泰勒虫临潭株、隆德株、张家川株和夏河株裂殖子蛋白进行了分析。SDSPAGE结果显示,羊泰勒虫临潭株与隆德株的亲缘关系较近;张家川株与夏河株的亲缘关系也比较近。4个虫株的阳性血清分别与4个株裂殖子蛋白的Westernblotting试验结果表明,4个株虫体的阳性血清与临潭株和张家川株的裂殖子蛋白在38ku处有共同反应。提示38ku蛋白多肽有望成为特异性诊断抗原,为重组疫苗的研究提供依据。     

感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞酵母双杂交文库的构建

为研究环形泰勒虫裂殖体与牛淋巴细胞之间的相互作用,以感染了环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞系为材料,构建了感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞系的酵母双杂交cDNA文库。首先,提取纯化细胞系的mRNA,经反转录合成第一条链cDNA,通过LD-PCR合成双链cDNA。柱层析剔除250bp以下的小片段;将双链cDNA与经SmaⅠ处理过的文库质粒pGADT7-Rec一起转入到酵母Y187感受态细胞内,双链cDNA与文库质粒会发生同源重组,经过抗性筛选即可得到酵母双杂交cDNA文库。文库构建结果显示,该文库库容量达2.4×107 CFU,插入片段的平均长度在1 000bp左右,达到试剂盒建库要求。     

吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析

提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。     

受小泰勒焦虫感染的牛成淋巴细胞培养的生长特性

曾从用东海岸热的病原小泰勒焦虫人工和自然感染的牛的脾脏培养其细胞。这些在形态上认证为成淋巴细胞的细胞是在悬浮培养中连续培养的。几乎每个细胞都受到无性裂殖体的侵袭。采自未感染牛的脾脏的培养则形成淋巴细胞,它们在悬浮培养中繁殖有限。