鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及其N基因片段的克隆和测序

通过形态学观察、动物回归试验、鸡胚接种试验、病毒干扰试验以及血凝试验分离鉴定了1株肾型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)。在透射电子显微镜下,病毒粒子多呈球形,直径为80~120 nm,有囊膜,表面有冠状突起。鸡胚连续盲传至第 1~2 代,开始出现死亡或出现侏儒胚;分离株可显著干扰NDV在鸡胚中的增殖;病毒尿囊液无凝血活性,但经5 g/L胰蛋白酶处理后,能够凝集10 mL/L的鸡红细胞。利用RT PCR技术对分离株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析比较,证实分离株为肾型IBV,命名为AH3 04株。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从陕西省榆林市某蛋用种鸡场疑似肾型传染性支气管炎病鸡中分离到了1 株肾型IBV(定名为YL 04),并对分离病毒进行了血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定及S1基因5′端的RT PCR鉴定。结果表明,该分离株经10 g/L胰酶处理后的各代病毒尿囊收集液均可凝集鸡红细胞;标准阳性血清可特异性地抑制其凝集性;可复制出与自然发病相同的病例;病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用;透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子;用RT PCR方法扩增到1 条373 bp的目的片段,其核苷酸序列与IBV CQ/01/2004株序列的同源性达98%。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

鸭源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定及其HA基因和NA基因的序列分析

本研究旨在了解鸭源H5N1亚型禽流感病毒的流行及遗传进化特点。采集健康鸭的肛门拭子,常规处理后接种于10日龄SPF鸡胚,收取24~96h内死亡鸡胚尿囊液,进行血凝和血凝抑制试验、核酸鉴定及HA和NA基因序列分析。结果表明,该分离株为禽流感病毒H5N1亚型,命名为A/Duck/Liaoning/N/2011(H5N1)。进化分析显示,HA基因的开放阅读框全长1 704nt,编码567个氨基酸;NA基因的开放阅读框全长1 350nt,编码449个氨基酸。HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为PQRERRRKR,含有多个碱性氨基酸,具有高致病性禽流感病毒的分子特征。该毒株属于新型H5N1亚型禽流感病毒2.3.2.1系,主要在东亚地区流行。该研究结果为进一步研究鸭源H5N1亚型禽流感病毒的分子进化提供了重要信息。     

鸡传染性喉气管炎病毒安徽株AH-XY15的分离鉴定

安徽省某鸡场120日龄蛋鸡发生疑似鸡传染性喉气管炎(ILT),根据Gen Bank发表的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)株g D基因设计合成1对特异性引物,从发病鸡喉头及其分泌物中扩增出1 134 bp大小片段。将病鸡喉头气管及其分泌物处理后接种SPF鸡胚,接种120 h后在绒毛尿囊膜(CAM)上形成典型痘斑,证实分离到1株鸡传染性喉气管炎病毒,命名为AH-XY15株。应用鸡胚传代的第4代病毒感染5日龄健康麻羽鸡,结果感染鸡出现了典型ILT临床症状,并能够从发病鸡喉头分泌物检出ILTV。应用PCR扩增分离株毒力基因TK基因和g B基因,序列分析显示,AH-XY15分离株TK、g B基因的核苷酸序列与国内WG株、国外USDA株以及国内疫苗株K317株同源性均在99%以上,氨基酸序列同源性在97%~99.8%之间。     

肾型传染性支气管炎病毒的鉴定和结构蛋白的表达

对分离自江苏省某发病蛋鸡群中1株病毒(Ck/Jiangsu/DS10/2008,DS10)进行了生物学特性鉴定。同时利用RT-PCR扩增该病毒的S基因、M基因和E基因并进行测序,与GenBank中其他参考株构建进化树,进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因、M基因和E基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9细胞进行表达,用间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。经生物学特性鉴定,DS10病毒为嗜肾型传染性支气管炎病毒(IBV)。遗传进化分析表明,各基因之间的遗传进化关系无明显相关性。间接免疫荧光检测表明,S蛋白、M蛋白和E蛋白在Sf9细胞中得到表达。琼扩试验证实,S基因和M基因的表达产物具有良好的反应性,而E蛋白未发现与阳性血清反应所产生的特异沉淀线,表明所表达的S蛋白和M蛋白具有良好的生物学活性,E蛋白可能因其自身分子质量小,在病毒中的含量较少相关。研究结果提示,现有传染性支气管炎疫苗对流行株保护效果不佳,表达的S蛋白、M     

鸡传染性支气管炎病毒real-time PCR检测方法的建立

针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因片段设计并合成了1对引物,将构建的重组质粒作为阳性标准品,成功建立了检测IBV核酸的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法。结果显示,该方法的线性关系好,标准曲线的相关系数达0.998 3;最低可以检测到1×101 copies/μL的核酸模板;与常见禽源病毒新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、马立克氏病病毒均不发生交叉反应,重复性试验的变异系数小于3%。应用建立的方法对人工感染IBV的20只试验鸡的40份气管和肾样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,攻毒后第5和第7天肾中病毒含量高于气管,证实了临床表现与病毒载量之间的关系。结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于IBV的病原检测及定量分析。     

鸡传染性支气管炎病毒SC株S1基因的序列分析

用RT PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)SC株S1基因 ,连接到 pMD 18 T载体上 ,克隆后进行了核酸序列分析 ,证实SC株S1基因与基因库中收录的国外毒株H12 0和M 4 1的同源性较低 ,分别为 81.1%和 80 .0 % ,而与国内JX990 1株的同源性达到 91.3% ,初步证实国内存在IBV新毒株。     

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株S1基因的序列分析

采用RTPCR方法扩增了12株鸡传染性支气管炎病毒中国分离株的全长S1基因,并进行了序列分析。通过与GenBank中登录的其他IBV参考毒株S1基因序列比较,进行了系统进化分析。结果表明,12株分离毒株属于同一个进化群的2个不同进化亚群。其中11株分离株与国内一些分离株亲缘关系最近,属于同一进化亚群,而广西分离株GX041则与欧洲毒株4/91亲缘关系较近,属于另一亚群。这些结果说明,中国各地的流行毒株变异较大,实际免疫中要根据流行毒株的特性选择合适的疫苗株来进行。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒JH9801株的分离鉴定

从天津市某肉用鸡场疑似肾型传染性支气管炎(NIB)病鸡中取肾组织,按常规处理后接种9-10日龄鸡胚,连续传代培养至第7代,并对4-7代分离毒株的致病性、血凝性、EID50及对DNV的干扰性和乙醚敏感性进行测试,同时进行了动物回归试验.结果表明,4-7代分离毒株可使85%-90%鸡胚于接种后8-9 d死亡,多数死胚和残存活胚胚体出血、蜷缩、矮化等具有IBV感染特征;该分离毒株无直接血凝性,但经10 g/L胰酶处理后可凝集鸡红细胞;分离毒株对乙醚敏感;动物回归试验中有65%的感染鸡在15 d内发病或死亡.剖检病死鸡可见肾苍白、肿胀,肾小管内充塞大量尿酸盐,外观呈菜花样.经鉴定,分离的病毒株JH9801为鸡肾型传染性支气管炎病毒(NIBV).     

Clade2.3.4 H5亚型禽流感疫苗变异候选株的构建

为应对Clade2.3.4H5亚型禽流感病毒持续发生的抗原性改变及其引发的潜在的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果制备疫苗候选株。采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的内部基因为骨架,以Clade2.3.4H5N1亚型AIV A/chicken/Hebei/2/2011(wt-HB株)的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因为供体,并删除wt-HB株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,成功拯救出1株重组病毒rHB/PR8。该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡和鸡胚无致病性。这一研究结果为防控变异的Clade2.3.4H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。     

一株洞庭湖候鸟新城疫病毒的分离鉴定及基因组特征分析

为监测湖南省洞庭湖候鸟携带新城疫病毒的现状,本研究于2014年春季在湖南洞庭湖畔采集了150份候鸟粪便样品。经SPF鸡胚分离纯化和RT-PCR鉴定,获得1株新城疫病毒,命名为Swan/Hunan/123/2014(HuN,GenBank登录号:KT894018)。利用RT-PCR方法扩增了HuN株全基因组,并进行基因组序列测定。序列分析表明,HuN株基因组长度为15 186bp,编码的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112 GK-Q-G-R-L117,符合新城疫经典弱毒株的分子特征。F基因相似性分析显示,其核苷酸序列与Queensland V4疫苗株、La Sota疫苗株和ZJ1毒株的同源率分别为99.8%、90.4%、81.3%。对HuN株的F基因、HN基因和全基因组遗传进化分析结果均显示,此毒株与Queensland V4株聚为一类,属于副黏病毒血清1型中的ClassⅡ类基因Ⅰ型新城疫病毒。     

三株腺胃型传染性支气管炎病毒分离毒株对鸡的致病性试验

为探明腺胃型传染性支气管炎病毒(IBV)对鸡的致病性,采用滴鼻、点眼和滴口方法,用QXIBV、DYIBV、FCIBV分离毒株对未免疫鸡和SPF鸡进行了攻毒致病回归试验。结果显示,未免疫的10日龄鸡攻毒后致死鸡的剖检变化与20日龄未免疫的被攻毒鸡相似,均有腺胃肿大,腺胃黏膜出血、溃疡,肾肿大、尿酸盐沉积等病变;20日龄(高日龄)攻毒鸡较低日龄(10日龄)攻毒鸡死亡率偏高。被攻毒的SPF鸡均出现精神沉郁、羽毛蓬乱、腹泻等与自然发病鸡相同的临床症状和病理变化(腺胃肿大,黏膜出血、溃疡,肾肿大、尿酸盐沉积等病变);被攻毒的未免疫鸡、SPF鸡与自然发病鸡死亡率相似。试验结果表明,用这3株腺胃型IBV分离株均能人工复制出与自然发病鸡基本一致的临床症状和病理变化。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及初步鉴定

河南一些养鸡场爆发流行以呼吸道症状为临床特征，以肾脏肿胀、尿酸盐沉积为病变特征的传染病。从典型病例的肺、肾中分离出一株病毒，通过鸡胚接种盲传５代，结合雏鸡回归试验、胰酶及磷酸酯酶处理鸡红细胞凝集试验，与Ｔ＿４标准阳性血清鸡胚病毒中和试验、琼脂扩散试验，证实分离物为Ｔ＿４株肾型传染性支气管炎病毒。     

乌骨鸡体内鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从具有鸡肾型传染性支气管炎（ＮＩＢ）临床病变特征的乌骨鸡体内分离到一株病毒。该病毒经鸡胚盲传６代后，可引起４０％以上鸡胚死亡，并出现典型的侏儒胚；人工感染雏鸡表现为肾肿大和尿酸盐沉积；能干扰新城疫ＬａＳｏｔａ株在鸡胚中的繁殖；病毒对氯仿和乙醚敏感，５６℃水浴３０分钟被灭活，耐ｐＨ３和ｐＨ１１；不能直接凝集红细胞，但经１．５％胰酶处理后能凝集鸡红细胞（１：５１２），这种血凝活性可被传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）澳大利亚Ｔ株阳性血清所抑制；电镜下可见直径约９０ｎｍ、大小一致的圆型病毒颗粒，表面有稀疏的纤突，长约２０ｎｍ，与冠状病毒形态相似。综合以上特性，证明所分离病毒为鸡肾型传染性支气管炎病毒（ＮＩＢＶ）。     

肾病-肾炎型鸡传染性支气管炎的病理学研究

对43只14日龄的SPF鸡人工感染从上海市分离获得的1株肾致病型鸡传染性支气管炎病毒(上海株IBV),分别于接种后第2、7、14、24、28和36 d扑杀,对肾、肺等组织器官进行了动态病理学观察。结果显示,感染鸡主要表现呼吸系统和泌尿系统的病理变化。在感染后的第2 d,支气管和气囊呈急性炎症变化;第5 d肾实质变性坏死,炎性细胞浸润,肺充血;第8~13 d,肾和肺的病变最为严重;第14 d后,支气管和输尿管转变为慢性炎症,肾出现弥漫性或局灶性间质性肾炎病理变化。将M41标准毒株与上海株IBV的致病力进行比较,发现2个毒株引起的呼吸器官病变基本相同,但M41毒株对肾的致病力较轻,未见间质性肾炎和输尿管炎病理变化。证实,上海株IBV主要侵害肺和肾,并造成肾实质变性坏死和间质性肾炎变化。     

C种禽腺病毒血清4型FAV-HN株的分离鉴定及致病性试验

对河南某疑似禽腺病毒发病鸡场采集的组织病料进行PCR鉴定,并通过病毒分离培养、遗传进化分析及动物致病性试验等对其进一步验证,最终分离得到1株C种血清4型禽腺病毒,命名为FAV-HN株。组织病料经研磨处理后,经PCR扩增得到与预期大小一致的Hexon基因片段;通过电镜观察,FAV-HN株具备腺病毒典型的形态特征;将FAN-HN分离株与NCBI数据库中C种血清4型禽腺病毒的序列进行同源性比对及遗传进化分析,结果发现该分离毒株与其他血清4型参考毒株Hexon基因的核苷酸同源性为99%,且属于同一分支。将FAV-HN分离株以不同剂量接种至SPF鸡,SPF鸡表现出心包积液、肝炎等特征性病变,且每只10~(7.0)TCID_(50)的感染剂量可使SPF鸡100%死亡。本研究为C种禽腺病毒血清4型的疫苗及诊断试剂的研发奠定了基础。     

禽腺病毒血清4型的分离鉴定及遗传演化分析

本研究从辽宁发病鸡群采集的病料经SPF鸡胚接种传代分离病毒,并其进行了PCR和测序分析鉴定。结果,从病料中经SPF鸡胚接种传代分离出一株禽腺病毒,经PCR和测序分析鉴定确定该分离株为禽腺病毒C种、血清4型,命名为LN160130;通过对52 k和hexon基因同源性比对,LN160130与我国近年报道的禽腺病毒血清4型同源性最高,52 k和hexon基因的同源性均为100%;与国外流行的血清4型毒株相比,LN160130的52k基因同源性99.3%~100%,hexon基因同源性98.7%~99.8%。遗传演化分析结果表明,LN160130分离株与我国禽腺病毒血清4型流行毒株在同一分支内,而与国外禽腺病毒血清4型毒株不在同一分支,存在遗传差异,说明中国流行的血清4型禽腺病毒有自身地域特点。