鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其致病性的研究

本研究从江苏省某鸡场疑似鸡传染性支气管炎(IB)的病料中,利用SPF鸡胚尿囊腔接种的方法分离出1株传染性支气管炎病毒(IBV),命名为CK/CH/JS/TZHY48。经RT-PCR检测,该株IBV的S1基因全长1 638 bp。遗传进化分析显示,分离株属于基因Ⅵ型,与常规疫苗株H120和H52的同源性较远。分离株对鸡胚有明显的致矮小化作用;对新城疫病毒有显著的干扰作用。动物回归试验结果显示,该分离株对7日龄SPF鸡的发病率为100%,致死率为40%,发病鸡出现气管啰音,甩头流鼻涕等呼吸道症状;病死鸡的剖检病理变化主要表现为肾苍白肿大,花斑肾,有大量明显的白色尿酸盐沉积,气管环出血。本研究可为IBV的遗传进化、致病机制以及免疫防控提供参考。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从陕西省榆林市某蛋用种鸡场疑似肾型传染性支气管炎病鸡中分离到了1 株肾型IBV(定名为YL 04),并对分离病毒进行了血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定及S1基因5′端的RT PCR鉴定。结果表明,该分离株经10 g/L胰酶处理后的各代病毒尿囊收集液均可凝集鸡红细胞;标准阳性血清可特异性地抑制其凝集性;可复制出与自然发病相同的病例;病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用;透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子;用RT PCR方法扩增到1 条373 bp的目的片段,其核苷酸序列与IBV CQ/01/2004株序列的同源性达98%。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒JH9801株的分离鉴定

从天津市某肉用鸡场疑似肾型传染性支气管炎(NIB)病鸡中取肾组织,按常规处理后接种9-10日龄鸡胚,连续传代培养至第7代,并对4-7代分离毒株的致病性、血凝性、EID50及对DNV的干扰性和乙醚敏感性进行测试,同时进行了动物回归试验.结果表明,4-7代分离毒株可使85%-90%鸡胚于接种后8-9 d死亡,多数死胚和残存活胚胚体出血、蜷缩、矮化等具有IBV感染特征;该分离毒株无直接血凝性,但经10 g/L胰酶处理后可凝集鸡红细胞;分离毒株对乙醚敏感;动物回归试验中有65%的感染鸡在15 d内发病或死亡.剖检病死鸡可见肾苍白、肿胀,肾小管内充塞大量尿酸盐,外观呈菜花样.经鉴定,分离的病毒株JH9801为鸡肾型传染性支气管炎病毒(NIBV).     

鸭2型腺病毒的分离鉴定及hexon基因的序列分析

为了鉴定广东惠州某鸭场疑似鸭肝病患病鸭的病原,通过接种11日龄番鸭胚,从发病鸭群病料中分离出1株未知病毒,经PCR鉴定为鸭2型腺病毒。选取第6代毒株进行血凝性、鸭胚致病性、致细胞病变、动物回归试验以及六邻体(hexon)基因序列分析。结果表明:接种病毒后第36~72小时,鸭胚集中出现死亡,胚体全身弥漫性出血,ELD_(50)为1×10~(6.31)/m L;分离的病毒不凝集鸡、鸭红细胞,在鸭胚成纤维细胞上可致细胞变圆、折光性增强等病变。将0.1 m L病毒液经肌肉接种1日龄泥鸭,主要引起雏鸭肝、脾出血和肿大。分离株hexon基因与GenBank数据库中CH-GD-12-2014株(登录号:KR135164.1)和GR株(登录号:NC_024486.1)的核苷酸同源性分别为100%和76.6%。本试验为深入研究鸭2型腺病毒的致病机制及综合防控提供了重要的基础数据。     

乌骨鸡体内鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从具有鸡肾型传染性支气管炎（ＮＩＢ）临床病变特征的乌骨鸡体内分离到一株病毒。该病毒经鸡胚盲传６代后，可引起４０％以上鸡胚死亡，并出现典型的侏儒胚；人工感染雏鸡表现为肾肿大和尿酸盐沉积；能干扰新城疫ＬａＳｏｔａ株在鸡胚中的繁殖；病毒对氯仿和乙醚敏感，５６℃水浴３０分钟被灭活，耐ｐＨ３和ｐＨ１１；不能直接凝集红细胞，但经１．５％胰酶处理后能凝集鸡红细胞（１：５１２），这种血凝活性可被传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）澳大利亚Ｔ株阳性血清所抑制；电镜下可见直径约９０ｎｍ、大小一致的圆型病毒颗粒，表面有稀疏的纤突，长约２０ｎｍ，与冠状病毒形态相似。综合以上特性，证明所分离病毒为鸡肾型传染性支气管炎病毒（ＮＩＢＶ）。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及初步鉴定

河南一些养鸡场爆发流行以呼吸道症状为临床特征，以肾脏肿胀、尿酸盐沉积为病变特征的传染病。从典型病例的肺、肾中分离出一株病毒，通过鸡胚接种盲传５代，结合雏鸡回归试验、胰酶及磷酸酯酶处理鸡红细胞凝集试验，与Ｔ＿４标准阳性血清鸡胚病毒中和试验、琼脂扩散试验，证实分离物为Ｔ＿４株肾型传染性支气管炎病毒。     

肾病-肾炎型鸡传染性支气管炎的病理学研究

对43只14日龄的SPF鸡人工感染从上海市分离获得的1株肾致病型鸡传染性支气管炎病毒(上海株IBV),分别于接种后第2、7、14、24、28和36 d扑杀,对肾、肺等组织器官进行了动态病理学观察。结果显示,感染鸡主要表现呼吸系统和泌尿系统的病理变化。在感染后的第2 d,支气管和气囊呈急性炎症变化;第5 d肾实质变性坏死,炎性细胞浸润,肺充血;第8~13 d,肾和肺的病变最为严重;第14 d后,支气管和输尿管转变为慢性炎症,肾出现弥漫性或局灶性间质性肾炎病理变化。将M41标准毒株与上海株IBV的致病力进行比较,发现2个毒株引起的呼吸器官病变基本相同,但M41毒株对肾的致病力较轻,未见间质性肾炎和输尿管炎病理变化。证实,上海株IBV主要侵害肺和肾,并造成肾实质变性坏死和间质性肾炎变化。     

猪源新城疫病毒的分离鉴定

从发生呼吸道症状的病猪鼻腔中分离到 1株病毒 ,经电镜观察、血凝和血凝抑制试验 ,确定为新城疫病毒。经对鸡胚平均致死时间、鸡胚半数致死量、对鸭胚和鸡、鸭的致死性测定及荧光PCR检测 ,证明分离毒为温和型毒株。     

三株腺胃型传染性支气管炎病毒分离毒株对鸡的致病性试验

为探明腺胃型传染性支气管炎病毒(IBV)对鸡的致病性,采用滴鼻、点眼和滴口方法,用QXIBV、DYIBV、FCIBV分离毒株对未免疫鸡和SPF鸡进行了攻毒致病回归试验。结果显示,未免疫的10日龄鸡攻毒后致死鸡的剖检变化与20日龄未免疫的被攻毒鸡相似,均有腺胃肿大,腺胃黏膜出血、溃疡,肾肿大、尿酸盐沉积等病变;20日龄(高日龄)攻毒鸡较低日龄(10日龄)攻毒鸡死亡率偏高。被攻毒的SPF鸡均出现精神沉郁、羽毛蓬乱、腹泻等与自然发病鸡相同的临床症状和病理变化(腺胃肿大,黏膜出血、溃疡,肾肿大、尿酸盐沉积等病变);被攻毒的未免疫鸡、SPF鸡与自然发病鸡死亡率相似。试验结果表明,用这3株腺胃型IBV分离株均能人工复制出与自然发病鸡基本一致的临床症状和病理变化。     

禽流感与新城疫二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用

根据禽流感病毒 (AIV)、新城疫病毒 (NDV)基因组序列高度保守区 ,设计合成了 2对引物 ,以AIV、NDV培养物提取RNA并反转录 ,进行RT PCR特异性片段扩增 ,扩增的片段大小分别为4 70和 32 0bp。结果 ,扩增产物与设计的 2对引物之间的序列大小一致。通过特异性与敏感性试验 ,AIV、NDV培养物均可扩增至 1 0 - 4,表明本方法对 2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及重组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒 (MDV) 2 .8kbgB基因 ,并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ酶切位点。然后用PstⅠ /NotⅠ酶切回收 gB片段 ,插入到转移载体 pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ /NotⅠ酶切位点处 ,构建了转移质粒pEFgpt12s gB。将该质粒与鸡痘病毒 (FPV)野毒 2 82E4株共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过MXHAT选择培养基进行筛选 ,蚀斑纯化 ,经PCR扩增证实重组病毒中含有 gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别 ,病毒效价分别为 10 -5.43 TCID50 /mL和 10 -6TCID50 /mL ,表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性     

猪伪狂犬病和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊治

广东省某猪场饲养母猪 60 0头 ,1999年 8月份初产母猪所产仔猪 3日龄开始发病 ,病猪以发热、尖叫、抽搐为主要特征 ,7日龄时有的整窝死亡。经确诊为伪狂犬病 (ＰＲ)和猪生殖与呼吸综合征 (ＰＲＲＳ)病毒混合感染。1　发病情况该场建于 1997年 8月 ,同年 9月从深圳某种猪场引进种公猪及后备母猪近 40 0头。 1998年 1月配种 ,生产正常。 1999年2月又从深圳某种猪场引进种公猪及后备母猪 2 0 0余头 ,1999年 4月配种。配种前 3 0ｄ左右按免疫程序分别注射了猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪链球菌病、猪细小病毒病、日本乙型脑炎和ＰＲ等疫苗 ,其中ＰＲ…     

口蹄疫病毒的纯化及鉴定

通过PEG 6 0 0 0沉淀 ,差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法提取纯化了口蹄疫完整病毒粒子 (FMDV ) ,经 30g/L磷钨酸负染后电镜观察 ,FMDV 14 6S为中心黑染的圆形颗粒 ,与中心透亮的FMDV空衣壳有明显区别 ,SDS PAGE和Western blotting试验结果表明 ,FMDV 14 6S电泳出现VP1、VP2、VP3三条结构蛋白带 ,其中VP1和VP3与阳性血清发生反应出现 2条明显的条带。     

羊口疮病毒的分离与鉴定

从发病山羊中分离到 1株羊口疮病毒 ,在犊牛睾丸细胞上产生明显的CPE ,感染 2月龄羊及成年兔均可产生与自然发病相同的症状 ,接种 2日龄小鼠则无任何症状出现 ;电镜观察该病毒颗粒呈椭圆形 ,有囊膜 ,大小在 2 2 5nm× 12 5nm左右     

人工感染仔猪猪生殖与呼吸综合征病毒的核酸分布规律

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC VR-2332保守区ORF6和ORF7的基因序列,设计了1条37 bp的寡核苷酸探针,末端用生物素标记.应用原位杂交方法对人工感染PRRSV SC-1株的28日龄仔猪进行了病毒核酸分布规律的研究.结果显示,感染后7～28 d于肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠和大脑检测到阳性杂交信号,其中肺门淋巴结的阳性信号一直较强,脾的阳性信号逐渐增强,肺的阳性信号较弱,心脏未见阳性杂交信号.     

鸭瘟病毒CY07株诱导的细胞凋亡及凋亡对其增殖的影响

通过荧光染色对鸭瘟病毒(DPV)CY07株诱导的细胞凋亡进行了测定,并通过real-time PCR测定了其在鸭胚成纤维细胞上的增殖规律,探讨了DPV CY07诱导鸭瘟发生的机制.结果显示,DPV CY07株诱导鸭胚成纤维细胞凋亡的凋亡率于接毒后第12 h时达到峰值12.85%,对照毒株鸭瘟标准毒诱导的细胞凋亡在接毒后第8 h达到峰值10.57%.DPV CY07株的数量在接毒后第20 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.02;鸭瘟标准毒的数量在接毒后第16 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.21,且试验结束时DPV CY07株的病毒量低于鸭瘟标准毒株.说明,DPV CY07株诱导细胞凋亡的能力较强,这可能是其毒力强的主要原因.     

口蹄疫A型灭活疫苗毒种和种子批的研究

为了保证制苗及攻毒用毒种的质量和稳定性,在对制苗和攻毒毒种的毒力、特异性、保存期、扩繁代次等进行研究的基础上,建立了口蹄疫A型灭活疫苗制苗和攻毒用毒种种子批。结果表明,原始毒种和基础毒种的扩繁代次均控制在5代以内,适宜的保存方法和保存期均为加含 500 mL／L甘油的PBS后在-30℃保存1年、-70℃保存2年;用于生产抗原的工作毒种,最高扩繁代次控制在15代以内,最佳保存方法和保存期为加保护剂后在-20℃保存半年、-70℃保存1 年;用于效力检验的攻毒毒种采用原始毒种。通过制苗和攻毒用毒种种子批的建立,规范了口蹄疫疫苗生产和检验过程中的毒种管理。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒分离株SD1009株感染性克隆的构建与病毒拯救

为探究蛋鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,从山东省某鸡场送检的蛋鸡病料中分离鉴定出1株ALV-J,命名为SD1009株,采用PCR方法分3段扩增出SD1009株的前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后顺次连接,获得1个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009。全长测序及序列比对分析发现,近年来分离的ALV-J都存在缺失部分rTM和DR区的序列,缺失长度为205bp。通过外源基因嵌合的方式,将205bp嵌合进入,又获得了1个前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009A205,将pBW-SD1009和pBW-SD1009A205分别转染DF1细胞,通过间接免疫荧光试验,禽白血病抗原试剂盒检测,反转录酶试剂盒检验,表明拯救出了2株病毒,分别命名为rSD1009和rSD1009A205。本研究成功构建了蛋鸡ALV-J的感染性克隆,并在序列分析的基础上,又构建了第2株补全缺失序列的感染性克隆,结果表明缺失部分rTM和DR区的序列,对病毒的拯救以及病毒的复制动力学无显著影响。     

猪伪狂犬病的诊断及病毒分离

猪伪狂犬病是由疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科的伪狂犬病毒 (PRV ,亦称猪疱疹病毒Ⅰ型 )引起的一种急性传染病。近年来 ,随着我国集约化养猪业的发展 ,从国外引进种猪较多 ,从而导致猪伪狂犬病的发生越来越严重 ,湖北、重庆、广东、江西、上海、广西等地都有本病发生的报道。湖北省宜城市某猪场的猪发生疑似伪狂犬病 ,笔者进行了临床检查 ,并采集病料进行了系统诊断及病毒分离鉴定。1　临床症状该场 80 %的妊娠母猪在预产期前 8～ 15d产死胎 ,但无其他临床症状 ,采食、体温均正常。初生仔猪表现怕冷 ,颤抖 ,拉稀 ,呕吐 ,呼吸困难 ,体温升高到 …