人工感染PRRSV仔猪肺和子宫细胞凋亡的电镜观察

应用透射电子显微镜对仔猪感染猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)后不同时期肺和子宫凋亡细胞的超微形态结构进行了观察。结果表明,PRRSV可诱导宿主肺和子宫发生典型的细胞凋亡,表现为细胞的超微形态结构随着病毒感染进程出现不同的特征性变化,早期(感染后第8 h至第3 d)凋亡细胞多表现为细胞体积缩小,细胞质密度增强,染色质浓缩,核仁解体,内质网扩张;中期(感染后第5 d至第9 d)凋亡细胞体积显著缩小,细胞膜突起,线粒体增多,有凋亡小体形成;晚期(感染后第10 d以后)凋亡细胞形态多表现为凋亡小体降解和消失,少数凋亡细胞在凋亡晚期表现为坏死细胞。肺细胞凋亡主要发生于肺巨噬细胞和肺泡上皮细胞,子宫细胞凋亡主要发生于子宫内膜细胞和内膜腺细胞。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。     

高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒,经RT-PCR检测,确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将此细胞病毒液命名为GDB1,用其感染回归5头40日龄健康仔猪,采集发病及死亡猪组织,重新用Marc-145细胞进行病毒分离,将再次分离到的病毒命名为GDB1F.对GDB1、GDB1F的Nsp2、ORF5基因序列进行测定分析.结果表明,单独感染猪2/2发病死亡,同居感染的3头猪全部发病,2头死亡;感染后2～4 d所有感染猪均出现体温升高.死亡猪表现为严重的出血性、间质性肺炎,肢体远端皮表出血.序列分析结果表明,GDB1和GDB1F株的Nsp2基因与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HN2 Nsp2、HNXT1、HNyz、HUB2、HUN1的同源性很高,达98.4%～99.0%.GDB1和GDB1F株的ORF5基因存在部分突变,没有缺失,与国内高病性PRRSV分离株JXA1、HUB2、JX0612、GDZC1的同源性高达97.5%～99.8%.     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

病猪肺组织中PRRSV抗原免疫组织化学Envision法的原位检测

为探讨肺组织中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原的定位诊断方法,制备了兔抗PRRSV抗体,采用免疫组织化学Envision法对疑似PRRS病猪肺组织中的病毒抗原进行了定位和半定量检测.SDS-PAGE和Western-blotting检测结果表明,制得的兔抗PRRSV IgG纯度较高,具有良好的特异性,可用于原位检测病猪肺组织中PRRSV抗原的分布;Envision法的检测结果显示,PRRSV抗原的阳性表达产物主要出现在肺巨噬细胞胞浆内,其次为肺泡上皮细胞和细支气管黏膜上皮细胞;通过对5份经RT-PCR检测确认的PRRS病猪肺组织进行检测.均有较高的阳性细胞表达,平均阳性细胞率为46.5%.证明Envi-sion法具有高敏感、低背景、快速简便的特点,可用于肺组织中PRRSV抗原的快速检测.     

PRRSV和PCV2共感染对猪肺泡巨噬细胞CD80-CD86 mRNA转录的影响

用猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)共感染40日龄健康大白仔猪,利用实时荧光定量PCR技术对共感染仔猪肺泡巨噬细胞(PAM)共刺激分子CD80-CD86的mRNA转录水平进行了定量分析。结果表明,在感染后第3 d和第7 d CD80与CD86 mRNA转录显著下调(P<0.05),感染后第14 d CD86 mRNA转录水平仍低于未感染对照组。尽管CD80 mRNA转录水平在第14 d和第28 d高于对照组,CD86 mRNA转录水平在第28 d高于对照组,两者在第42 d均高于对照组,但无显著差异。证实,PRRSV和PCV2共感染可导致猪肺泡巨噬细胞的共刺激分子CD80-CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PAM的抗原呈递能力受到影响。     

金丝桃素体外抗高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒活性的研究

为研究金丝桃素体外对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性的影响,以Marc-145细胞培养增殖的PRRSV为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),测定吸光度值(D490nm)和半数细胞感染量(TCID50),以细胞存活率、病毒抑制率和TCID50为指标,评价不同剂量的金丝桃素体外抑制PRRSV活性的效应,并通过改变加药方式(同时、感染前、感染后给药).探讨其抗PRRSV的作用机制.结果表明,在PRRSV感染的同时加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率略有升高,与PRRSV对照组和拉米夫定对照组相比,均有显著性差异(P<0.01).在PRRSV感染前和感染后加入金丝桃素,其细胞存活率和对PRRSV的抑制率明显升高,且随药物浓度的增加而上升,与PRRSV对照组相比,有显著性差异(P<0.01),与拉米夫定对照组相比无统计学意义(P>0.05).金丝桃素可使PRRSV的TCID50从6.1下降至4.15.证实,金丝桃素具有多环节体外抗PRRSV效应;不同浓度的金丝桃素表现出不同的抗PRRSV活性,并呈现剂量依赖关系.     

长江中下游地区规模化猪场猪繁殖障碍性疾病的病原学检测

应用PCR与RT-PCR方法,检测了127份来自于长江中下游地区7省市24个规模化猪场患繁殖障碍的病猪的病料,检测病原包括猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及日本脑炎病毒(JEV).结果显示,在上述127份样品中,有10份样品为PRRSV单独感染,占检测样品数的7.87%,有54份样品为PRRSV与PPV混合感染,占样品总数的42.52%,有50份样品为PRRSV与PCV-2混合感染,占样品总数的39.37%;有15份样品为PRRSV与PRV混合感染,占样品总数的11.81%;有8份样品为PRRSV与JEV混合感染,阳性率为6.30%;有18份样品为PRRSV与CSFV混合感染,占样品总数的14.17%.提示,长江中下游地区规模化猪场的猪群普遍存在PRRSV与PPV、PCV-2、JEV及PRV的混合感染.     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒侵入介体的研究进展

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵入宿主细胞的途径,介绍了PRRSV的细胞嗜性和其侵入的介体(硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素和CD163等),以及它在病毒侵入宿主细胞时所表现的生物学功能,提出了PRRSV入侵猪肺泡巨噬细胞的一般途径。     

截短的猪生殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

根据GenBank上登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列,设计了1对引物用于扩增PRRSV M基因,经PCR、酶切及测序鉴定,成功构建了PRRSV M基因原核表达载体.重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting结果显示,出现一分子质量约为27.3ku的目的蛋白带,该表达蛋白可与PRRSV猪阳性血清发生特异性反应.表明,表达的蛋白具有良好的特异性.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染仔猪的病理学分析

通过系统地对临床感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株引起的仔猪的肺脏、脾、淋巴结等组织进行了组织病理变化和超微病理变化的观察。结果,PRRSV变异株的病理损伤以间质性肺炎为特征,伴有淋巴结、肝、脾、肾、心脏、胃和肠等器官细胞的变性坏死。肺泡巨噬细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、淋巴结及脾脏中的淋巴细胞均被不同程度的感染,并含有大量病毒粒子。肺部组织细胞病变最严重,甚至部分肺泡巨噬细胞趋于死亡,各种细胞器遭受普遍性的膜结构损伤,而以线粒体和细胞核变化较为严重。上述研究结果丰富了PRRSV变异株感染仔猪的病理学资料,为进一步搞清其致病机理和危害提供了理论依据,对该病的病理学诊断及防控具有一定的指导意义。     

青海省农业区主要猪病的流行病学调查

采用ELISA检测方法和流行病学调查方法,于2004~2005年对青海省互助、湟中、大通、乐都、民和、西宁6县(市)的142个规模养猪场和部分养殖户进行了猪瘟、猪生殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型感染、伪狂犬病等流行状况的调查。结果显示,猪瘟、猪生殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型感染、伪狂犬病在青海省农业区普遍存在,6县(市)之间血清抗体阳性率无明显差异;母猪繁殖障碍覆盖了所有种猪场,后备母猪不发情率约为8.2%,产死胎、木乃伊、弱仔的母猪占繁殖母猪的21%左右;猪瘟仍然是引起当地猪死亡的主要原因。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型猪体共感染发病模型的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)多以混合感染的形式,广泛存在于世界各地的猪群。本研究选取35日龄的阴性健康猪,随机分为4组:PCV2感染组(n=5)、PCV2+PRRSV共感染组(n=5)、PRRSV感染组(n=5)和空白对照组(n=4)。攻毒后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重并于不同时间采血,攻毒后第21天剖杀所有猪,荧光定量PCR检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果表明,PCV2+PRRSV共感染组猪的临床症状最严重,并死亡2头。病理变化主要表现为肺出血、明显的间质性肺炎,淋巴组织及淋巴细胞缺失严重,淋巴滤泡中出现大量核浓缩深染的淋巴细胞;PCV2单独感染组与PRRSV单独感染组猪的临床症状轻微,仅出现短暂性体温升高;空白对照组未出现症状。病毒血症检测结果显示,两种病毒共感染组猪的血清中PCV2与PRRSV含量均高于单独感染组。本研究成功建立了PRRSV与PCV2猪体人工共感染发病模型,为PRRSV与PCV2协同致病机理研究奠定了基础。     

断奶仔猪蓝耳病的诊治

猪蓝耳病又称猪生殖与呼吸综合征 (PRRS) ,是由猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)引起的一种以猪的繁殖障碍和呼吸道病为特征的传染病。该病1987年首先在美国报道 ,1996年初我国首次从疑似PRRS感染猪群中检出PRRSV抗体并分离出PRRSV ,现已有 2 0多个省 (市 )报道此病 ,目前该病几乎遍及全球主要养猪国家和地区 ,给养猪业造成了不可估量的损失。北京郊区某规模养猪场断奶仔猪于 2 0 0 0年 1月发生PRRS ,笔者对发病仔猪进行了诊断和综合防治 ,5个月后病情基本平息。1　发病及死亡情况该猪场保育舍存栏断奶仔猪 16 0 0多头 ,此次发病 …     

猪生殖与呼吸综合征病毒△Gp5/M/N串联基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR方法从猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株VR2332中扩增△Gp5、M和N基因片段,通过重组PCR方法得到串联基因△Gp5/M/N,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS,筛选表达PRRSV pET-△Gp5/M/N蛋白的菌株.经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和western-blotting.结果表明,PRRSV pET-△Gp5/M/N蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,纯化后的蛋白可与PRRSV阳性血清发生特异性反应.证明原核表达系统表达的PRRSV pET-AGp5/M/N蛋白具有良好的反应原性.     

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法.敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL.表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测.     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。