绵羊源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确从新疆某绵羊养殖场送检的病死羊的致病菌,对病死羊的心脏、肝和肺组织采用细菌分离培养、形态观察、生化试验,纯化菌落进行种特异性和荚膜血清型PCR鉴定以及药敏试验、致病性试验和动物回归试验。为了解分离菌株的生物学特性及免疫原性,笔者以BALB/c小鼠为动物模型对分离株进行同源性和异源性的免疫攻毒保护试验。结果显示,在BHI琼脂培养基上长出灰色、光滑小菌落,革兰氏染色为红色的小短杆菌;分离株能发酵葡萄糖等,符合多杀性巴氏杆菌(Pm)的生化特性;PCR扩增出大小为460bp的种特异性条带和1 045 bp的荚膜血清A型特异性条带,Blast检索结果与Pm的同源性为99.7%。结果表明,分离菌为多杀性巴氏杆菌,属于荚膜血清A型。药敏试验显示,该菌株对头孢拉定、环丙沙星、替米考星等7种药物具有敏感性;该菌株能够引起实验小鼠和兔的发病死亡,根据羔羊的发病情况和临床表现,本菌为强致病性菌株;将分离株培养物研制成不同佐剂的灭活疫苗探究其免疫效果,氢氧化铝佐剂灭活疫苗可以抵抗同源菌的攻击,保护率能够达到100%;对异源血清型Pm免疫攻毒保护效果差,对D型、F型和未知型的保护率分别为20%、20%、0。本研究成功分离出1株绵羊A型多杀性巴氏杆菌,对羊巴氏杆菌病的流行监测和防控具有重要意义。     

兔F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其致病性

对从山东某獭兔养殖场病死仔兔肺中分离的1株疑为巴氏杆菌菌株进行了菌落形态学观察及培养特性、革兰氏染色、生化反应、仔兔致病性回归试验、小鼠毒力试验,并采用PCR方法对该分离株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰氏染色阴性,生化试验及PCR鉴定结果显示为F型多杀性巴氏杆菌,能引起獭兔仔兔肺出血、坏死,并致部分仔兔死亡。表明该分离菌株为比较少见的兔F型多杀性巴氏杆菌。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。     

猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为确定导致猪细菌性感染死亡的病原,从送检病死猪肺中分离纯化出1株细菌,通过对该菌株进行培养特性观察、生化反应、药敏试验、动物致病性试验,并采用PCR对该分离菌株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰染色为阴性。生化试验及PCR鉴定结果显示,该分离菌株为荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌,其对小鼠有强致病性。此次分离的这株多杀性巴氏杆菌形态结构和生化特性比较典型,毒力较强,且为较少见的荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌。这一结果为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定了基础。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其毒力基因的检测

取病死鸡肝接种于血清琼脂平板,挑取符合巴氏杆菌特征的单菌落进行纯化培养和染色镜检;对纯培养菌提取核酸,进行16S r RNA、kmt1和cap A基因的PCR鉴定,7个管家基因的PCR扩增和多位点序列分型,以及12个毒力基因的PCR检测;并进行分离菌的动物回归试验。结果显示,分离的2株病原菌(HN-1和CZ-6)均为两极浓染的革兰阴性短杆菌,16S r RNA和kmt1基因序列与多杀性巴氏杆菌的同源性均高于99%,荚膜血清型鉴定为A型,基因型为ST129型,除tox A、ptf A、nan H之外的9个毒力基因均被检出,动物回归试验表明分离菌对鸡的致病性较强。结果表明,这2株鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定为我国禽源菌株的遗传特性研究提供了一定参考。     

水貂A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及免疫原性研究

从送检的疑似多杀性巴氏杆菌感染的水貂中分离到1株病原菌,经培养特性、形态观察、生化试验、PCR鉴定等,确定RC1108菌株为血清A型多杀性巴氏杆菌。水貂回归试验表明,该菌株毒力较强,最小致死剂量为2.5×10~8CFU。制备的灭活疫苗在含菌量为1.5×10~9 CFU/m L时,即可在免疫后第21天提供保护。表明,该分离菌株可以作为水貂血清A型多杀性巴氏杆菌疫苗的候选株。     

鸭源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及喹诺酮类药物敏感性分析

为明确贵州省某鸭场病死鸭组织中的病原菌,本研究对病(死)鸭的肝、脾、脑等组织进行病原菌的分离纯化、形态观察和多杀性巴氏杆菌特异性基因kmt1鉴定,并对分离菌株进行荚膜血清型试验、同源性分析、动物回归试验以及喹诺酮类药物敏感性试验。结果表明,本研究分离得到的7株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,菌株在血平板上培养形成圆形、微突起、表面光滑、奶油状的菌落,且扩增的kmt1基因序列与NCBI公布的序列同源性达到99%以上。细菌基因组间重复序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus, ERIC)-PCR电泳结果表明,7株鸭源多杀性巴氏杆菌具有相同的扩增片段,同源性较高,为同一克隆株。动物回归试验显示该菌具有较强的毒力。喹诺酮类药物敏感性试验表明,分离株对不同代喹诺酮类药物敏感性不同,对第一代药物萘啶酸耐药,对第二代药物氟甲喹以及第三代药物恩诺沙星、环丙沙星、二氟沙星、达氟沙星和沙拉沙星敏感,且二氟沙星较其他药物更易抑制菌株耐药。本研究结果为养殖场巴氏杆菌的防控提供参考,同时也为延缓细菌耐药性的产生提供参考。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株(占57.8%),D型菌株27株(占38.0%),F型菌株3株(占4.2%),71株多杀性巴氏杆菌中包括1株D型产毒素多杀性巴氏杆菌(占1.4%),说明当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。应用PCR检测多杀性巴氏杆菌23种毒力基因,结果显示:多杀性巴氏杆菌毒力基因的数量大多分布在15~19之间,平均携带个数为17.5个;23种毒力基因中,ptfA,fimA,hsf-2,sodA,sodC,ompA,ompH,oma87,plpB,exbB,tonB,Fur,hgbB的检出率在90%以上,而toxA基因的检出率极低(1.4%),并且在猪源多杀性巴氏杆菌中未检测到t bpA的存在;分析毒力基因在不同血清型菌株中的携带及分布情况发现,A型的平均毒力基因携带数为18.2个,D型为16.4个;不同毒力基因在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中的分布也存在一定的差异,其中唾液酸代谢酶基因nanB、透明质酸酶基因pmHAS及黏附基因tadD和pfhA在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率高于其在D型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01);而黏附基因hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率显著高于其在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01)。对所分离菌株的16SrRNA基因进行测序,并与NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因进行进化树分析,结果显示:71株多杀性巴氏杆菌主要分为2个亚群,亚群Ⅰ和HB03及3480的亲缘关系较近,而亚群Ⅱ则与HN06、Pm70、36950等菌株的亲缘关系较近;遗传进化的结果说明,多杀性巴氏杆菌的亲缘关系与其来源、血清型及其导致的疾病种类并没有表现出特定的亲缘关系。     

粤西地区两株鹅源鸭疫里氏杆菌的分离鉴定

从疑似患有鸭疫里氏杆菌病的病死雏鹅分离病原菌并对分离到的菌株进行了形态学观察、生化试验、血清型鉴定、PCR鉴定、药敏试验及16SrRNA基因序列分析。结果显示,2个分离菌株为Ⅰ型鸭疫里氏杆菌;它们均对22种常用抗生素表现出耐药。这2株鹅源分离株与鸭源鸭疫里氏杆菌处于同一进化支上,与同属rRNA总科Ⅴ的伯杰氏菌属、金黄杆菌属、黄杆菌属的进化关系较近,与大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌的进化关系较远。     

鸭传染性浆膜炎油佐剂灭活疫苗的研究

以1、2型鸭疫里默氏菌分离株为菌种研制了1型鸭传染性浆膜炎单价油佐剂灭活疫苗和1、2型鸭传染性浆膜炎二价油佐剂灭活疫苗.经过无菌及安全检查合格后,对7日龄雏鸭经颈部皮下接种0.5 mL/只,免疫后14、24 d用相同血清型强毒攻击,保护率达90%～100%.单价疫苗免疫后2周内,抗体水平持续上升,从第3周开始缓慢地下降,5周时仍然维持在较高水平.通过攻毒保护试验和抗体消长规律的测定表明,鸭传染性浆膜炎油佐剂灭活疫苗具有良好的免疫保护作用.     

禽大肠埃希氏菌融合菌株疫苗的研制及应用

对从陕西省主要养鸡地区病死鸡分离的禽致病性大肠埃希氏菌进行Omp分型 ,用不同Omp型的菌株构建成融合菌株。用融合菌株制作铝胶灭活疫苗 ,与单价疫苗和两亲本菌株双价疫苗的免疫保护效果进行比较。结果表明 ,融合菌株疫苗可对多种O血清型致病性大肠埃希氏菌的攻毒试验产生坚强的保护 ,保护率高达 93%～ 10 0 % ,而O血清型单价疫苗的保护率仅 6 7%～80 % ,双价疫苗的保护率仅 80 %。在生产中对蛋用鸡的应用结果表明 ,融合菌株疫苗可明显降低鸡的死淘率。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊,无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定,对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果,该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌;药敏试验表明,分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感,对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感,对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药;耐药基因检测显示,该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因;动物试验表明,接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡,接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡,死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明,该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株,是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊。无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定，对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果，该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌；药敏试验表明，分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感，对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感，对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药；耐药基因检测显示，该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因；动物试验表明，接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡，接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡，死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明，该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株，是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

多重PCR在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用

为了修订行业标准《猪巴氏杆菌病诊断技术》(NY/T 564-2002),改进多杀性巴氏杆菌荚膜定群方法,制备了多杀性巴氏杆菌分群抗血清,并建立了多重PCR,对53株菌同时用血凝方法及多重PCR进行定群。经正向间接血凝试验测定,制备的各型血清仅与对应型抗原发生凝集反应,表明血清具有较高的特异性,可作为多杀性巴氏杆菌的荚膜定群抗血清。53株多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Carter氏间接血细胞凝集试验结果相一致。结果表明,可将多重PCR增添至行业标准中,用其代替原有血清学方法进行多杀性巴氏杆菌荚膜定群。     

牛A型多杀性巴氏杆菌三聚体自转运蛋白免疫保护性的研究

为研究多杀性巴氏杆菌三聚体自转运蛋白(TAAs)的免疫保护效果,在对牛A型多杀性巴氏杆菌Pm CQ2株假定TAAs编码基因Pm1g0001的黏附基序分析基础上,对其黏附基序进行PCR扩增,并与质粒p ET-32a(+)连接,将重组质粒转入BL21(DE3)诱导表达获得重组蛋白,纯化后与佐剂混合免疫小鼠,三免后收集小鼠血清检测抗体效价,并用Pm CQ2菌液进行攻毒保护性试验。结果显示,Pm1g0001的黏附基序具有TAAs的典型结构,重组蛋白r Pm1g0001免疫小鼠后可以刺激机体产生高效价抗体,对Pm CQ2的保护率达60%,具有良好的免疫保护效果,提示牛A型多杀性巴氏杆菌三聚体自转运蛋白可以作为研究新型亚单位疫苗的候选靶标。     

四川省畜禽多杀性巴氏杆菌菌体抗原的血清学鉴定

1955～1961年,Carter氏用间接血球凝集法,根据菌株的不同荚膜物质,将多杀性巴氏杆菌分为A、B、D、E四型。1961年,Namioka和Murata氏以1N盐酸处理细菌,制成菌体抗原,用试管凝集法,将菌体抗原分为不同的1、2、3……12种变异群,并与Carte氏的荚膜群相结合,形成15个血清型。为了查明我省畜禽多杀性巴氏杆菌的血清学型别,我们在荚膜抗原分群的基础上,对从416株中选出的有代表性的171株菌,采用Namioka和Murata氏叙述过的分型法,进行了菌体抗原的血清学鉴定。     

禽霍乱荚膜多糖菌苗的研究——菌苗制造与品质测定

禽霍乱(Fowl Cholera)是当前危害养禽业发展的重要疫病之一。由于引起该病的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的抗原结构极为复杂,免疫机制不甚清楚。我们于1981年对禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜物质的免疫原性进行了初步研究,证实多杀性巴氏杆菌的荚膜物质具有良好的抗原性,是建立特异性免疫的重要物质。并于1982年在对研制本菌苗所使用的菌种、提取荚膜物质的方法、筛选适当的佐剂等研究的基础上,进一步对本菌苗的制造工艺流程、质量检测进行了研究。     

禽霍乱双型原生质体融合株的筛选及其免疫原性研究

以抗链霉素、对卡那霉素敏感的禽源多杀性巴氏杆菌Ｐ１０５９株（血清型为８Ａ）和抗卡那霉素、对链霉素敏感的Ｃ４８－１株（血清型为５Ａ）为亲本，在脱氧核糖核酸酶Ⅰ（ＤＮａｓｅⅠ）始终存在的条件下，以聚乙二醇（ＰＥＧ，分子量６０００）为助融剂，进行原生质体融合，然后在高渗琼脂平板上再生细胞壁，再转种于含卡那霉素和链霉素的双抗培养基上检出融合株。对筛选获得的２个融合株（简称为Ｆ２和Ｆ６）进一步研究表明，其在形态、染色特性、生化反应和毒力等方面均符合禽源多杀性巴氏杆菌的特性。通过血清型鉴定和双抗药性试验证明两亲本株菌细胞确已发生了原生质体融合和染色体重组，经反复继代培养证明融合株表型稳定。用Ｆ２制备的灭能苗免疫小白鼠，１４ｄ后攻毒，对两型标准强毒菌混合培养物１个ＭＬＤ保护率为１００％，１０个ＭＬＤ保护率为８０％。     

牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H重组亚单位疫苗对小鼠的免疫保护效果

为分析牦牛源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫保护效果,将纯化的牦牛源多杀性巴氏杆菌重组外膜蛋白H(rOmpH)制备成疫苗,用该重组疫苗和全菌灭活疫苗皮下免疫小鼠。首免后每周采血1次,用间接ELISA方法检测其抗体动态变化,并于三免后第9天用2LD50的分离株进行攻毒,比较两者的保护力。结果显示,全菌灭活疫苗组小鼠30h后死亡率为20%,重组疫苗组小鼠30h后100%死亡,PBS对照组小鼠24h后100%死亡。结果表明,全菌灭活疫苗具有保护力,而重组蛋白疫苗保护性微弱。     

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理,采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51-17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pm9616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因,并对其进行序列分析。将C51-17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中,将重组表达载体pET30a-prfA转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95.6%~100%,在氨基酸水平上的同源性为98.9%~100%。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45.6ku,与预期的大小一致,以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应,具有良好的反应原性。