小鼠PVM血清抗体Ⅰ-ELISA检测法的建立及其应用

对实验小鼠感染小鼠肺炎病毒(PVM)用间接酶联免疫吸附试验(Ⅰ-ELISA)进行检测,其敏感性、特异性、重复性和稳定性均达到满意效果.结果显示,用PVM接种BHK21细胞经初、高、超差速离心浓缩制备的抗原,与仙台病毒(Sendai)、小鼠肝炎病毒(MHV)和呼肠孤病毒3型(Reo-3)的免疫小鼠血清抗体不产生交叉反应,阻断抑制率大于50%;Ⅰ-ELISA与HI对50份小鼠血清检测比较,其阳性检出率分别为30%和20%;将制备的检测抗原在-20℃保存6个月效价稳定.Ⅰ-ELISA操作简便,适用于大批样品的检测.     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

马动脉炎病毒血凝抑制试验研究及其应用

用马动脉炎病毒(EAV)免疫SPF豚鼠,4周后采血做血凝抑制试验(HI),其抗血清可以抑制血凝抗原对小鼠红细胞的凝集反应,抗原和抗血清在4℃感作24 h后可以检测到最高的HI抗体效价,同时结果显示HI抗体与中和抗体产物呈正相关.对561份来自新西兰、吉尔吉斯、沙特阿拉伯及内蒙古、新疆的马血清用HI试验和微量血清中和试验(NT)进行EAV抗体检测,HI和NT阳性符合率为94.7%,血凝抑制抗体与中和抗体效价呈显著的正相关.     

猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

猪瘟病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速、准确的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,根据Gen Bank上猪瘟兔化弱毒全基因序列,设计1对引物,扩增E2蛋白主要抗原区基因片段;然后,将其克隆入载体p ET-28a(+),采用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达出含E2蛋白主要抗原区的重组蛋白。以纯化的截短E2蛋白为包被抗原,优化间接ELISA反应条件,建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA。经过优化,确定最佳抗原包被浓度为8 g/m L,待检血清稀释倍数为1∶160,酶标二抗稀释倍数为1∶2000。该方法的阳性临界值为0.37,阴性临界值为0.32。批内变异系数在1.58%~3.33%之间,批间变异系数在2.67%~5.35%之间,说明该方法重复性良好。特异性检验中,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清均没有交叉反应。用该方法与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对1 101份临床猪血清样品进行符合性检测,结果,该方法的敏感性、特异性、符合率分别为89.07%(603/677)、77.59%(329/424)和84.65%(932/1101)。上述结果表明,该方法可用于临床CSFV血清抗体的检测,为CSFV血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

油酸人工抗原的合成及其单克隆抗体的制备

为建立奶牛血清中油酸(OA)含量的免疫学检测方法,将油酸用活泼酯法分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,制备人工抗原和包被原;利用薄层色谱法(TLC)和红外光谱法鉴定人工抗原合成是否成功;用OA-BSA常规免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选出阳性细胞株,再用有限稀释法进行亚克隆;采用小鼠体内诱生法制备腹水,Hi Trap Protein G HP纯化柱纯化腹水,并对纯化后的腹水用ELISA检测抗体效价,以及抗体亚型鉴定。结果表明,TLC监测抗原合成过程中有新物质生成,红外图谱显示OA-BSA波谱形态与BSA相似且拥有OA的特征峰;小鼠血清抗体效价为1∶12 800,用ELISA方法筛选出1株细胞G-1,抗体亚型为Ig G1型。为建立油酸的免疫学检测方法奠定了基础。     

乳牛孕酮人工抗原的制备与鉴定

采用二环己基碳化二亚胺偶联法将孕酮-11α-半琥珀酸酯(11-αOH-P4-HS)分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体偶联,制备乳牛孕酮人工抗原P4-BSA和P4-OVA,并用SDS-PAGE对制备的人工抗原进行测定。再用制备的人工免疫抗原P4-BSA免疫BALB/c小鼠制备免疫血清。用P4-OVA作为ELISA检测抗原,方阵滴定法确定检测抗原的最佳包被浓度,间接ELISA测定免疫血清中抗体的特异性及效价。结果表明,成功制备了乳牛孕酮人工抗原,P4-OVA的最佳包被浓度为5.82×10-5ng/mL,最佳封闭液为50 mL/L的羊血清,免疫血清具有良好的特异性。     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

猪盖塔病间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确、敏感性高、特异性好的猪盖塔病检测方法,采用超速离心纯化的灭活盖塔病毒(Getah virus,GETV)作为抗原包被ELISA板,分别用GETV免疫小鼠腹水和正常小鼠腹水作为阳性、阴性对照,建立检测猪盖塔病的间接ELISA方法。采用棋盘滴定法确定最佳抗原包被质量浓度,为7.795ng/mL;通过对70份阴性猪血清的检测,确定判定标准;特异性试验表明,该方法与同属病毒以及其他易感病毒之间无血清学交叉反应,具有良好的特异性;用所建立的ELISA方法与血清中和试验(SNT)、间接免疫荧光试验同时检测不同GETV抗体效价的猪血清,结果表明该间接ELISA敏感性最高,且检测用时最短;用金标准SNT检验所建立的ELISA方法,结果显示这2种方法的一致性为88.89%,Kappa为0.776,具有较高的一致性。用建立的GETV间接ELISA方法对双江县90份临床样品进行检测,阳性率为47.78%,提示双江县猪群中存在GETV感染,盖塔病对养猪业存在潜在风险。结果表明,成功建立了猪盖塔病间接ELISA检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法的建立

采用差速离心、膜包超滤浓缩和Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶层析相结合的策略纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),建立了一种温和纯化PRRSV的方法。通过SDS-PAGE、Western-blot和检测病毒含量、蛋白含量等方法分析纯化效果。用纯化后的病毒免疫BALB/c雌性小鼠,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测其免疫原性,并与超速离心沉淀病毒的纯化方法相比较,评估纯化病毒的免疫效果。结果显示,4FF纯化后的病毒TCID_(50)提高了50倍,与超离方法相比,4FF纯化法将病毒原液杂蛋白的去除比率由97.51%提高到99.68%,SDS-PAGE显示未见明显杂蛋白条带,IPMA结果显示4FF纯化病毒的免疫原性较好,特异性较强,消除了免疫后小鼠血清与Marc-145细胞蛋白的非特异性反应。结果表明,4FF纯化方法优于超离纯化方法,前者的建立为制备单克隆抗体和规模化纯化PRRSV疫苗的工艺开发奠定基础。     

应用间接免疫荧光试验检测猪圆环病毒抗体

用猪肾传代细胞系PK 15增殖猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )毒株制备抗原 ,建立了检测PCV抗体的间接免疫荧光试验 (IFA)。应用该方法对 64份临床送检血清样品进行了检测。结果 ,3 8份血清呈现PCV抗体阳性 (5 9% )。IFA方法的建立为临床上进行PCV流行病学调查及相关疾病的诊断提供了另一种检测手段。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因疫苗和重组E2蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备了5株单克隆抗体(4G3、3B2、3F8、2H6、3A11),并对这些单克隆抗体的亚类、免疫原性及其与瘟病毒的反应性进行了检测.结果显示,4G3、382、3F8、2H6为IgM类抗体,3A11为IgG类抗体;纯化后的单克隆抗体与纯化前比较,与抗原的反应性略有提高;5株单克隆抗体与BVDV和猪瘟病毒(CSFV)均有交叉反应性.表明,制备的5株单克隆抗体所针对的是BVDV和CSFV共有的抗原表位.     

鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系建立

(一)材料 1.病毒:传染性法氏囊病病毒F_(16)(IBDVF_(16))引自哈尔滨兽医研究所;新城疫病毒(NDV)由本所提供。 2.小白鼠骨髓瘤细胞系:NS-1和Sp 2/0均引自解放军兽医大学军事兽医研究所。 3.动物:8～12周龄BALB/C小鼠引自卫生部北京生物制品研究所。 (二)抗原制备 把IBDV-F_(16)经30日龄公鸡体内增殖后,收集病变明显的法氏囊制成乳剂,测其病毒滴度为10~7TCID_(50)/0.1ml,-30℃保存备用。使用时常规离心、硫酸铵沉淀、高速离心,同时用密度梯度超速离心制备纯化IBDV抗原。提纯后的抗原经磷钨酸负染,JFM—T电镜观察(放大117000倍),病毒粒子呈六角形,大小为60nm。提纯病毒的蛋白含量为3.25mg/ml。     

猴麻疹病毒抗体免疫梳检测方法的建立及应用

为了建立猴麻疹病毒(MeV)抗体的快速检测方法,本研究采用基因工程技术制备MeV的MeV-32基因原核表达产物即重组MeV-32蛋白作为抗原诊断试剂,以期建立免疫梳方法用于特异性检测实验猴血清中抗MeV的抗体Ig G。结果显示,最佳抗原包被量为0.1 mg/m L;制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴MeV阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,MeV-32蛋白能够敏感地检测到1∶100倍稀释的MeV阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对10份可疑猴血清样品进行检测,免疫梳方法与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。上述结果表明,该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立

应用xMAP液相芯片技术原理,以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原,建立了检测牛白血病病毒抗体的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性与稳定性试验。结果表明,该方法对牛白血病病毒阳性血清检测阳性,对其他常见牛病毒阳性血清检测阴性,表明特异性好;液相蛋白芯片方法对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7ng/μL,对多份牛白血病病毒阳性血清的检测结果显示该方法的检测敏感性与商品化ELISA试剂盒无显著差异;对3份牛白血病病毒阳性血清进行4次重复检测,批内、批间的变异系数均低于10%。所制备的偶联微球芯片保存3个月,其检测结果无显著差异。采用该方法对169份临床牛血清样品进行检测,检出阳性率达57.4%,该检测结果与瑞典进口ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.67%。本方法为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。     

基于金纳米颗粒标记非洲猪瘟病毒p30蛋白免疫层析检测方法的建立

为建立一种用于非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的快速检测方法,本研究将特异性高、抗原性强的重组ASFV p30蛋白用金纳米颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体(ASFV-p30-Ab)包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),制备ASFV p30金纳米颗粒免疫层析抗体检测试纸条,并对该方法开展了初步评价。结果表明,该试纸条可在5-10 min完成检测;以健康猪血清、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等阳性血清作为对照,该方法仅特异性的检出ASFV感染的血清阳性样品,与各对照组血清无交叉反应;以进口ASFV抗体ELISA检测试剂盒作为金标准对阴、阳性样品进行对比检验,该试纸条检出的敏感性和特异性分别为92.52%和92.00%,说明本研究制备的ASFV p30抗体金纳米颗粒检测试纸条具有较高的敏感性和特异性,具备操作简便、检测快速和结果判断容易等特点,具有ASF现场检测的实际应用价值。     

貉狐源阿留申病病毒的感染检测与基因特征

为检测新发现的貉狐阿留申病病毒(RFAV)感染并分析该病毒的基因特征,应用PCR、对流免疫电泳(CIEP)和碘凝集(IAT)试验检测RFAV感染的貉、狐样品;用阿留申病病毒属保守引物对RFAV进行PCR扩增、测序并进行序列分析。结果显示,2012至2014年77只可疑RFAV感染病兽的PCR检测阳性率为81.8%,其中58份PCR阳性血清用AMDV-G抗原的CIEP检测的阳性率是100%,IAT检测的阳性率为92.0%。而健康貉、狐用PCR、CIEP和IAT检测均为阴性。RFAV的4个代表毒株蛋白NS1、VP2氨基酸序列与水貂阿留申病病毒(AMDV)的相似性分别小于76.7%、92.1%,与同属的灰狐阿留申病病毒(GFADV)的相似性更低。与AMDV和GFADV毒株相比,RFAV的NS3蛋白序列较短,为66aa;VP2蛋白的半胱天冬酶裂解位点417DTLS/A421是S420,不同于其他2种病毒的D420;NS1蛋白的半胱天冬酶裂解位点226EE/T228,与其他2种病毒不同。所有测序的RFAV高变区核酸序列进化树显示,RFAV形成阿留申病病毒属的一个新分支。3种方法检测结果分析表明,AMDV-G毒株抗原适用于狐、貉RFAV感染后抗体的CIEP检测;IAT试验可用于RFAV导致的貉高γ球蛋白血症检测。RFAV基因特征表明其不同于水貂阿留申病病毒,是自然感染貉和蓝狐的新种阿留申病病毒;这提示应采取有效措施预防貉、狐的阿留申病病毒感染。     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

猪水泡病病毒三种抗原颗粒的特性

曾用蔗糖和氯化铯梯度离心法从猪水泡病病毒的细胞培养收获物中分离到三种不同的颗粒。病毒粒子(148S)、无RNA空衣壳(81S)和一种也无RNA的第三种颗粒(49S)与猪水泡病病毒抗血清都显示出了免疫反应性。81S和49S颗粒具有自然产生的空衣壳典型的多肽。曾用纯化抗原注射给天竺鼠制备了用免疫扩散法可以区别空衣壳和病毒粒子的抗血清;49S抗原似乎与病毒粒子类似。用在幼小白鼠脑内繁殖,新制备的病毒抗原制造的抗血清,可区别猪水泡病病毒和在血清学上与其相关的科赛奇B_5病毒,但是不能区别各种沉降颗粒抗原。当在天竺鼠血清中孵育时,部分纯化病毒制备物将降解为空衣壳。本文讨论了空衣壳和49S颗粒可能的来源以及它们与病毒制备物抗原性的关系。     

鸡减蛋综合征诊断抗原与超免疫血清的研制

将鸡减蛋综合征(EDS)种毒AV-127、AV-HS-1接种鸭胚,孵育120 h后,收取尿囊液测定其血凝(HA)效价,加体积分数0.2%甲醛灭活作为诊断抗原;将病毒对鸡、兔进行3次免疫,当抗体效价达到29以上时分离血清,制备成超免疫血清.试验证明,该EDS诊断抗原和超免疫血清具有特异性强、敏感性高等特点,可用于感染鸡群的疫情调查、免疫鸡群的抗体水平监测、EDS的预防、治疗和对减蛋综合征病毒(EDSV)进行深入研究.