乙醇与乌头碱联合染毒对大鼠心肌细胞RYR2的影响

目的研究不同浓度乙醇与乌头碱联合染毒对大鼠心室肌细胞RYR~2蛋白表达的影响。方法用优化的方法进行新生大鼠心室肌细胞原代培养,设置4组实验组,分别为A、B、C、D组,即分别用1μmol/L乌头碱、5mmol/L乙醇+1μmol/L乌头碱、50mmol/L乙醇+1μmol/L乌头碱以及100mmol/L乙醇+1μmol/L乌头碱进行染毒,同时设立对照组(E组)。染毒1h后,用Western blot技术检测RYR~2蛋白含量,重复实验,将对所得数据进行统计分析。结果 1μmol/L乌头碱作用1h,使培养的大鼠心肌细胞RYR~2蛋白量增加;5mmol/L乙醇、50mmol/L乙醇分别与乌头碱联合染毒组中RYR~2蛋白表达量均较单独乌头碱染毒组低;100mmol/L乙醇-乌头碱联合染毒组RYR~2蛋白量与单独乌头碱染毒组相较未见明显差异。结论乙醇-乌头碱联合染毒对RYR~2的蛋白量有明显影响,不同浓度乙醇与乌头碱联合染毒对RYR~2的影响效果不一致,低浓度乙醇能拮抗乌头碱引起的RYR~2含量增加,随着乙醇浓度逐渐升高,拮抗作用逐渐减弱,且有向协同作用转化的趋势。     

乌头碱对新生大鼠心肌细胞DNA损伤的影响

目的探讨乌头碱对新生大鼠心肌细胞DNA损伤的影响。方法新生SD大鼠20只,随机分为4组,取心室肌以差速贴壁法原代培养心室肌细胞。培养第6天,制成密度为2×105个细胞/mL的细胞悬液,分别加入乌头碱混合液至终浓度为0.1、0.5、1、2μmol/L,染毒30m in;采用彗星电泳技术及CASP分析软件,检测不同浓度乌头碱染毒后心室肌细胞DNA损伤程度。结果心肌细胞被不同浓度乌头碱染毒后,尾部DNA含量、彗尾长度、尾矩、O live尾矩均随乌头碱浓度增加而升高,头部DNA含量则逐渐降低,与对照组相比,有显著性差异(P<0.01);乌头碱染毒剂量越大,心肌细胞DNA损伤越严重。结论乌头碱染毒引起细胞DNA断裂损伤呈明显的剂量—效应关系,推测细胞DNA损伤是乌头碱毒作用机制之一。     

急性心肌缺血猝死例左室心肌Cx43脱磷酸化的免疫组化研究

目的观察急性心肌缺血所致心性猝死,特别是冠心病猝死者与对照组,左室心肌闰盘上缝隙连接蛋白Cx43磷酸化状态的差异,探讨其在急性心肌缺血心律失常的发生,及其诊断心肌缺血早期病变中的意义。方法应用免疫组化SP技术,检测无明显心肌梗死的冠心病猝死组(组Ⅰ)、其他急性心肌缺血所致心性猝死组(组Ⅱ、Ⅲ)和两对照组(组Ⅳ、Ⅴ,严重颅脑损伤或病理性颅内出血所致急性死亡),共45名死者的左心室局部心肌组织(存档蜡块)中Cx43的磷酸化状态。另选用抗心肌闰盘上粘合连接的主要蛋白Pan-Cadherin的抗体和生物素化菜豆凝集素(PHA-E+L/Bio),分别检测心肌细胞间机械耦联与心肌细胞膜的完整性(后者采用亲和组化技术),以便在实验中与Cx43免疫组化染色结果作比较分析。结果⑴在实验组各例标本的心肌闰盘上磷酸化Cx43明显缺染,少数呈点状弥散于胞浆;但在两对照组中,可见磷酸化Cx43聚集于心肌闰盘处。⑵Pan-Cadherin在各例标本中均表现为心肌闰盘处的强阳性着色。⑶各组标本其心肌细胞膜均显示良好,细胞轮廓清晰可辨。结论急性心肌缺血所致心性猝死者,左室心肌细胞间机械耦联和心肌细胞膜的完整性与对照组相比,无明显改变,但闰盘处主司电耦联的缝隙连接蛋白Cx43却发生了明显的脱磷酸化。这提示,后者可能是急性心肌缺血所     

高效液相色谱法测定草乌中乌头碱含量

目的建立反相高效液相色谱方法定量分析药材生草乌中乌头碱的含量。方法XTerraTMRP185μm,(150mm×4.6mm)色谱柱;流动相为乙腈:10mmol·L-1碳酸氢铵50∶50(V/V)等度洗脱;流速1.0ml/min;检测波长230nm。结果乌头碱的线性范围为5～20μg,最小检出浓度为0.5μg/ml。结论该方法灵敏、快速、准确,适用于生药、饮片、药酒中乌头碱的检测。     

Cx45、Cx40及TNF-α在梗死心肌中表达及作用

目的检测缝隙连接蛋白Cx45、Cx40及TNF-α在梗死心肌中的表达情况,探讨三者的作用及相关性。方法应用免疫组织化学染色(S-P免疫组化染色法)及q RT-PCR检测缝隙连接蛋白Cx45、Cx40及TNF-α分别在30例早期心肌缺血猝死组、30例晚期心肌梗死猝死组及20例正常心肌组中的表达情况,并分析三者的作用及相关性。结果免疫组化结果:在两个猝死组中,Cx45表达高于正常心肌组,Cx40表达较正常心肌组明显减少,TNF-α呈高表达,三者在三组中的表达存在显著差异,有统计学意义(P0.05)。q RT-PCR结果显示:Cx45、Cx40及TNF-α三者的mRNΑ表达与各自蛋白本身表达相一致,在三组中表达存在显著差异,差异性有统计学意义(P0.01)。Cx45、Cx40、TNF-α在三组心肌中存在相关性。结论缝隙连接蛋白Cx45、Cx40及TNF-α将可能成为心源性猝死死因的辅助诊断指标。     

超高效液相色谱-质谱联用法测定生物检材中乌头碱

目的建立一种简单、快速测定生物检材(血液、尿液、胃内容物)乌头碱的超高效液相色谱-质谱联用法。方法样品采用乙腈沉淀处理。色谱柱为UPLC C18(2.1mm×50mm,1.7μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸,梯度洗脱,流速为0.4m L/min,柱温40℃。采用ESI离子源,MRM模式检测。结果乌头碱在血液0.5~500ng/m L,尿液1~1000ng/m L浓度范围内线性良好(r>0.995)。乌头碱方法回收率在91.3%~110.2%之间;提取回收率在72.8%~83.5%之间;日内、日间RSD均小于14%。结论本方法简单、快速检测生物检材中乌头碱。     

药酒中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的LC/MS/MS分析

目的应用高效液相色谱-质谱联用法对涉案药酒中有毒成分乌头碱、次乌头碱、新乌头碱快速定量分析。方法样品过膜后用乙腈稀释500倍,使用Waters ACQUITY UPLC BEN C18(100 mm×2.1 mm,1.7μm)色谱柱,以乙腈-10 mmol/L碳酸氢铵溶液(pH=10)为流动相梯度洗脱,多反应监测模式下测定涉案药酒中乌头生物碱的含量。设定方法下乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的保留时间分别为5.10 min、5.64 min、4.58 min,用于定量分析的离子对(m/z)分别为646.6-586.6、616.6-556.6、632.7-572.6。在1~200 ng/mL内,乌头碱线性回归方程为Y=343.8X+38901(R2=0.9995);在100~1000 ng/mL内,次乌头碱线性回归方程为Y=3.817X-357.579(R2=0.9991);在0.5~10 ng/mL内,新乌头碱线性回归方程为Y=719.562X+128.748(R~2=0.9995)。用此方法检测出涉案药酒中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱含量分别为71.85,415.86,1.49μg/mL。结论建立的高效液相色谱-质谱法可用于药酒中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱的快速测定。     

青壮年猝死综合征心肌细胞内Cx43的表达

目的观察连接蛋白43（Cx43）在青壮年猝死综合征（SMDS）者心肌细胞的表达,并探讨其法医学意义。方法筛选法医尸检案例45例,其中SMDS组、冠心病猝死组及对照组各15例。采用免疫组织化学和图像分析技术对不同组别Cx43蛋白在心肌细胞内的表达进行阳性单位（PU）定量检测,分析Cx43蛋白在各组表达的差异。所得数据进行统计学分析。结果 SMDS组心肌Cx43染色明显减弱,阳性着色条带分布不均、深浅不一,有的呈散在颗粒状;冠心病猝死组亦见类似变化;对照组未见明显变化。经统计分析发现,3组心肌细胞内Cx43表达的PU值存在显著性差异（P〈0.05）。结论 SMDS死前存在心肌缺血及心电紊乱,应属心性猝死范畴。     

乌头碱在家兔体内的代谢动力学初步研究

本文应用甲醇-0.05mol/L碳酸铵水溶液-二氯甲烷(90:10:2)作流动相,在YWGC_(18)H_(37)反相键合相色谱柱上分离乌头碱和内标,用紫外分光检测器在235nm外定量,改进了动物组织内痕量乌头碱的HPLC检测法。运用该法检测家兔静脉注射乌头碱后的血毒物浓度,初步研究了乌头碱在家兔体内的代谢动力学过程,表明其体内过程符合开放二室模型,T_(1/2α)=1.4682min,T_(1/2β)=34.1379min。体内乌头碱可以原形由尿和胆汁中排出,但以前6h尿排泄为主。     

高效液相色谱法快速分离测定血浆中的乌头碱

目的建立血液中乌头碱的高效液相色谱快速分析方法。方法以空白人血浆添加乌头碱标准品对血液样品的前处理方法、仪器测试条件、线性范围、精密度、回收率进行全面考查,建立乌头碱定量分析方法。对血液中所含乌头碱的浓度进行测定。结果该方法在血液中的线性范围是0.1~5.0μg/m l;最低检测浓度为0.1μg/m l;日内、日间精密度分别小于3.7%和4.5%;回收率在(97.0±4.1)%以上。结论所建方法实用、便捷,可对血液中乌头碱的含量进行快速测定。     

挤压伤大鼠早期心脏损伤的细胞机制

目的观察挤压伤大鼠血清对培养的新生大鼠心肌细胞的某些作用,拟阐明挤压伤早期心肌细胞损伤的细胞机制。方法培养1～3d龄SD大鼠心肌细胞,观察挤压伤大鼠血清对心肌细胞搏动频率、表面积、蛋白质含量、3H-亮氨酸掺入、胞内钙浓度和Fos蛋白表达的影响。结果与正常大鼠血清组比较,挤压伤大鼠血清培养的心肌细胞搏动频率(次/min)由88.3±20.6降为26.4±16.7,心肌细胞表面积、蛋白质含量、3H-Leu掺入、胞内游离钙浓度(nmol/L)和Fos蛋白表达阳性指数增加。结论挤压伤大鼠血清通过抑制细胞搏动,增加胞内钙浓度诱导Fos蛋白的表达,引起心肌细胞肥大,介导挤压伤早期的心脏损伤。     

中介素（IMD）对大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤的作用

目的探讨中介素（IMD）对大鼠体外培养心肌细胞缺氧-复氧损伤的作用。方法用大鼠H9c2心肌细胞株制作实验模型,样本分为对照组、缺氧-复氧组（缺氧1h、复氧30min）、IMD组（缺氧-复氧前30min加入10-7mol/L IMD）。采用MTT比色法检测心肌细胞活力;透射电镜观察细胞超微结构;激光共聚焦显微镜观察并测定细胞内钙离子浓度;流式细胞术测定细胞凋亡率。结果与对照组比较,缺氧-复氧组和IMD组细胞存活率显著降低,而IMD处理组明显升高细胞存活率（P〈0.01）;在形态学上,IMD预处理可明显减轻缺氧-复氧对大鼠心肌细胞的损伤;缺氧-复氧组细胞[Ca2＋]i荧光强度和细胞凋亡率比对照组显著升高,IMD预处理可明显降低上述升高的比率（P〈0.01）。结论 IMD对大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤有一定保护作用,提高心肌细胞存活率、减轻心肌细胞钙超载和抑制凋亡是其作用途径。     

液相色谱质谱联用测定乌头碱在大鼠体内代谢产物

目的鉴定乌头碱在大鼠体内的主要代谢产物。方法灌胃给予雄性大鼠1.0mg/kg乌头碱后,收集24h尿液,固相萃取法提取,液相色谱-质谱法测定乌头碱及其代谢物。结果经与空白组对照发现给药后大鼠尿样中除乌头碱原体外还有4种代谢产物,并分别测得其准分子离子峰及其各级碎片离子。结论经与对照品比较及质谱断裂规律推断4个代谢产物分别为中乌头碱、16-O-去甲基乌头碱、16-O-去甲基中乌头碱、苯甲酰乌头碱。     

乌头中剧毒生物碱的提取分离

目的从乌头属植物中提取分离剧毒生物碱乌头碱、中乌头碱、次乌头碱;方法酸性水溶液提取,碱化后中性氧化铝柱层析,IR、EI-MS确认结构;结果利用该方法提取以上3种生物碱得到的回收率与碱性苯溶液法相似。结论该方法所用试剂成本低、毒性小,适用于制备乌头碱、中乌头碱、次乌头碱对照品。     

大鼠乌头碱中毒心肌酶的研究(Ⅲ)——线粒体NADHD的组织化学和细胞化学研究

本文用组织化学和细胞化学方法分别对乌头碱染毒后不同时间组大鼠心肌NADHD进行了光镜和电镜观察。结果表明:乌头碱染毒后30分钟,2小时和4小时的大鼠心肌NADHD活性明显降低并有定位改变,而染毒后12、24小时的心肌NADHD活性有所回升。证实产能较多的NADH氧化呼吸链在乌头碱中毒时受到抑制。     

高效液相色谱法分离测定药酒中乌头碱的含量

目的建立药酒中乌头碱的高效液相色谱快速分析方法。方法以白酒添加乌头碱对照品对药酒样品的前处理方法、仪器测试条件、线性范围、精密度、回收率进行全面考察,建立定量分析方法。对药酒中所含乌头碱的浓度进行测定。结果该方法乌头碱在药酒中的线性范围是0.45～9.0μg·mL-1;日内、日间精密度分别小于3.1%和4.7%;回收率在(97.3±2.8)%以上。结论所建方法实用、便捷,可对药酒中乌头碱的含量进行快速检测。     

咖啡因对乳鼠脑皮质神经元凋亡的作用

目的考察咖啡因对乳鼠脑皮质神经元凋亡的作用。方法取出生后2-3d的乳鼠脑皮质神经元,在37℃、5%CO2、100%相对湿度的培养箱中培养7d后,分别加入终浓度为300μmol/L和1 000μmol/L的盐酸咖啡因培养液,继续培养6-36h后,流式细胞仪测定细胞内钙离子浓度、线粒体膜电位和细胞凋亡率,酶标仪测定Caspase-9的活性,电镜和Hoechst 33258荧光染色观察细胞的形态学改变。结果与正常组相比较,300μmol/L和1 000μmol/L盐酸咖啡因组在给药后6h的钙离子平均荧光强度明显增强（P〈0.05）,由正常值43.13±2.02分别增加到45.28±1.16和46.92±1.99;在给药后8h的线粒体膜电位下降最明显（P〈0.05）,由正常值443.58±11.77分别下降到289.53±16.47和165.14±14.72;在给药后10h的Caspase-9活性最高（P〈0.05）,由正常值1.00±0.000分别增加到5.33±1.02和8.33±0.92;在给药后36h的细胞凋亡率明显升高（P〈0.05）,由正常值4.94±1.74分别增加到15.98±2.03和18.70±2.09;在给药后24h荧光显微镜下见典型凋亡小体。结论咖啡因对乳鼠脑皮质神经元凋亡有促进作用。