免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法的初步研究

应用兔抗副溶血弧菌IgG-2包被硝酸纤维素膜检测线,山羊抗兔IgG包被对照线,胶体金标记兔抗副溶血弧菌IgG-1制成检测试纸条,建立了检测副溶血弧菌的免疫金层析试纸条法(IGCA)。结果显示,阳性者试纸条检测线和对照线均出现红色线,试验过程仅需5～15min即可判断结果,该法对副溶血弧菌的最低检测量为3.592×104 CFU/mL,与溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、麦氏弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门氏菌等常见肠道菌不发生交叉反应。将试纸条4℃存放6个月,常温存放3个月,37℃存放1个月,检测结果无差异。结果表明,建立的试纸条检测方法操作简便快速、灵敏度高、特异性强和稳定性好,非常适于基层养殖部门应用。     

猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为建立一种猪瘟病毒的快速检测方法,采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金,选择15 nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体,对胶体金标记抗体采用低温超速离心法进行纯化,组装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测,同时用直接荧光抗体试验和RT-PCR做平行试验。结果显示,用试纸条检测猪瘟病毒,10 min左右即可显示结果,试纸条、直接猪瘟荧光抗体试验和RT-PCR的阳性检出率依次为36.36%(4/11)、45.45%(5/11)和72.72%(8/11)。表明,用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便,需时短,可以用于猪瘟的流行病学调查。     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。     

鹅细小病毒胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立一种快速、简便地检测鹅细小病毒(GPV)的方法,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,将其标记于抗GPV VP3蛋白单克隆抗体2D5上,在硝酸纤维素膜上喷涂抗GPV VP3蛋白单克隆抗体4A8和山羊抗小鼠IgG抗体作为检测线和质控线,制成检测GPV的胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该试纸条检测GPV的最低TCID50为1×104.15/mL,用制备的试纸条仅检测GPV为阳性,而检测其他主要水禽病的病原结果均为阴性;同一批次和不同批次的试纸条对GPV阳性样品的检测结果均无差异。使用该试纸条对已知的80份粪便样品进行检测,阳性及阴性样品的检测符合率分别为96.49%和100%。结果表明,制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,为"小鹅瘟"的快速诊断提供了新的方法。     

A群猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

为建立一种快速、简便的猪轮状病毒检测方法,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗猪轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体,在硝酸纤维素膜上喷加纯化的抗猪轮状病毒VP6蛋白多克隆抗体和羊抗鼠IgG,制成检测猪轮状病毒抗原的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测猪轮状病毒感染的MA104细胞培养物,在检测线处出现红色反应带,未感染病毒的细胞培养物在检测线处未出现反应条带,上述培养物在质控线处均出现红色反应条带;进一步试验表明,试纸条检出病毒培养液(TCID50是10-6.25/0.1 mL)的最低限为1∶32稀释;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与相关的腹泻病毒猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒发生反应,所制备的试纸条具有一定的敏感性和特异性,重复性良好。     

奶牛乳房炎四种致病菌PCR核酸免疫层析试纸条快速检测方法的建立及应用

为了开发检测导致奶牛乳房炎的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和停乳链球菌这四种重要致病菌的PCR核酸免疫层析试纸条方法,本研究采用柠檬酸还原法制备10 nm的胶体金溶液,选用优化的10μL 1 mol/L碳酸钾溶液调节pH和5μL异硫氰酸荧光素抗体偶联金颗粒,并使用优化的封闭液(10%BSA、0.25%PEG2000、0.05%吐温-20、0.05%Triton-X100)进行封闭,将地高辛抗体和山羊抗鼠二抗分别喷涂在检测线和质控线上,烘干并组装成试纸条,进行细菌的纯培养物和鲜牛奶加样检测。结果显示,所制备的PCR核酸免疫层析试纸条和凝胶电泳均具有较好的特异性,最低检测限要比凝胶电泳高10倍,在模拟污染牛奶样品测试中,试纸条仍然具有很好的特异性且灵敏度比凝胶电泳的高。上述结果表明,本研究建立的PCR核酸免疫层析试纸条检测方法具有良好的临床应用潜力。     

弓形虫抗体免疫胶体金快速检测试纸条的研制

将样品垫(加样区)、包被了弓形虫排泄分泌抗原和胶体金结合物的结合垫、包被了弓形虫排泄分泌抗原和抗弓形虫抗体的硝酸纤维素膜、吸水垫依次首尾互相衔接粘贴在白色塑料板上,组装成检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条。然后用其进行动物弓形虫病血清抗体检测,并用弓形虫IHA诊断试剂进行对照试验。经对已知弓形虫阴、阳性血清检测,与弓形虫IHA检测结果的符合率为82.5%,金标试纸条较弓形虫IHA诊断试剂能提前2 d检测到抗体。结果表明,检测弓形虫抗体免疫胶体金试剂(金标试纸条)的敏感度高于IHA。     

布鲁氏菌血清抗体量子点荧光微球检测试纸条的研制

为研制一种现场快速筛查布鲁氏菌病的免疫层析试纸条,本研究以量子点荧光微球作为示踪物,共价偶联布鲁氏菌外膜蛋白OMP22,并将布鲁氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22的单克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线和质控线,组装试纸条。结果显示,量子点荧光微球试纸条检测阳性血清的最大稀释度为1∶512,检测布鲁氏菌病阳性血清的敏感性为99%,特异性为98%,与虎红平板凝集试验(RBPT)的符合率为99%。且与结核病、蓝舌病、病毒性腹泻、口蹄疫及小反刍兽疫血清无交叉反应。上述结果表明量子点荧光微球免疫层析试纸条检测速度快、灵敏度高、特异性强且成本低,适用于布鲁氏菌病的现场筛查。     

狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸的制备及其应用

为了建立一种快速检测狂犬病病毒抗体水平的方法,用浓缩提纯的狂犬病病毒CVS11株作为胶体金标记抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白为检测线上的捕获抗原,制备狂犬病病毒抗体水平检测试纸条。应用该试纸条进行临床样品检测,结果表明,以稀释后的犬全血或血清作为检测样品,试纸条检测的灵敏度为0.002U/mL,特异性试验证明该试纸条与犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒2型犬科疾病阳性血清没有交叉反应,稳定性试验证明该试纸条在室温下保存的有效期为12个月,检测结果与快速荧光抑制试验的符合率为95.12%。证实该狂犬病病毒抗体免疫金标检测试纸可以方便、快速、灵敏、特异地检测狂犬病病毒的抗体水平。     

大肠杆菌F_5菌毛胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立一种特异、稳定、敏感的检测产肠毒素大肠杆菌F5菌毛的胶体金免疫层析方法,用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗F5菌毛单克隆抗体,并喷涂在结合垫上;将纯化的兔抗F5菌毛多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被于硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线;组装试纸条,进行敏感性、特异性、稳定性、重复性试验,并对模拟样品和临床样品进行初步检测。结果显示,对F5菌毛蛋白的最小检出量为38.2μg/mL;与大肠杆菌F4、F6、F41和F18ab菌毛无交叉反应;4℃条件下密封保存120d后仍能有效检出样品;批内、批间检测F5菌毛蛋白的结果没有差别且检测线清晰,具有良好的重复性;对14份临床样品检测的结果与间接夹心ELISA、平板凝集试验、PCR的符合率为100%。     

斑点免疫金渗滤法检测猪生殖与呼吸综合征抗体的研究

应用提纯的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原包被硝酸纤维素膜,然后用胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)建立了检测PRRS抗体水平的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)。该法通过胶体金标记SPA直接显色,阳性者出现红色斑点,整个试验过程仅需5min即可判断结果;与猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病阳性血清不发生交叉反应;纯化PRRSV抗原的最低检测量为0.0553mg mL,即55.3ng 点。对200份猪血清用该法与ELISA同时进行PRRS抗体检测,两种方法的符合率达98%。     

牛传染性鼻气管炎抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测

将无血清细胞培养的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗原包被于硝酸纤维素膜,加入待检血清样品后,利用纳米胶体金标记的山羊抗牛IgG显色,建立了检测IBR抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测试纸盒。整个试验过程仅需5min即可判断结果,与蓝舌病、牛赤羽病、牛地方流行性白血病、牛病毒性腹泻黏膜病、猪瘟、猪伪狂犬病和猪细小病毒病的阳性血清不发生交叉反应。将该法与用于IBR抗体检测的ELISA方法同时对300份临床牛血清样品进行IBR抗体检测,结果二者的阳性符合率达94.4%。结果表明,该法具有特异、敏感、快速可靠、效果直观、结果容易判断的特点,非常适用于IBR的早期诊断和流行病学调查。     

马动脉炎病毒RT-LAMP检测方法的建立

为建立一种快速、简便、特异性高的马动脉炎病毒反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,针对马动脉炎病毒膜基质蛋白M基因的保守序列设计特异性引物,优化反应条件,建立了马动脉炎病毒的RT-LAMP检测方法并对其特异性和灵敏性进行了检测。结果显示,建立的RT-LAMP检测方法具有良好的特异性,灵敏度为0.12pg,是普通RT-PCR的100倍,检测时间仅需1h,肉眼即可观察检测结果。表明建立的RT-LAMP检测方法可用于进出口马动脉炎病毒的检疫。     

猪链球菌抗体GDH重组蛋白PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪链球菌重组谷氨酸脱氢酶(GDH)蛋白作为包被抗原,酶标葡萄球菌A(PPA)蛋白为二抗,建立了检测猪链球菌抗体的间接PPA-ELISA诊断方法。经方阵滴定确定了抗原的最适包被浓度为12.5mg/L,血清样品的最佳稀释倍数为1∶80,PPA-ELISA阳性反应的临界值为D450nm≥0.378,交叉反应试验结果表明,该重组抗原与其他常见的6种猪病的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。经与武汉科前动物生物制品有限责任公司的商品化猪链球菌抗体检测试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;对320份血清进行猪链球菌抗体检测,阳性检出率为73.1%。试验证明,所建立的PPA-ELISA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高,为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供了有效的技术手段。     

猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。