残缘璃眼蜱人工培育及对环形泰勒虫的实验性传播

将采自内蒙古自治区的残缘璃眼蜱(Hyalomma detritum)饲喂于牛体,观察了成虫、幼虫、若虫在实验室饲喂条件下的生活周期及滞育现象;通过蜱传播试验证实,残缘璃眼蜱饥饿幼虫、若虫吸入病原,其蜕化之若虫、成虫能将环形泰勒虫(Theileria annulata)传播给敏感动物,而幼虫阶段吸入病原,如若虫阶段在兔体饱血,所蜕化产生的饥饿成虫不传播该病.     

甘肃省羊泰勒虫媒介蜱的传播试验

用采自羊泰勒虫病疫区甘肃省永靖县的麻点璃眼蜱饥饿成虫叮咬健康羊体,试验羊体内未发现羊泰勒虫;用其饱血雌虫孵化的幼虫叮咬羊泰勒虫感染羊,收集饱血若虫,再用其饥饿成虫叮咬健康羊体,被叮咬羊体内也未查出羊泰勒虫,证明麻点璃眼蜱不传播羊泰勒虫.用采自羊泰勒虫病疫区张家川和永靖县的青海血蜱经人工孵化的幼虫叮咬羊泰勒虫自然感染羊,收集饱血幼虫蜕皮后,用其若虫叮咬健康羊,40 d后在被叮咬羊血片中发现羊泰勒虫,但未显示明显的临床症状.用采自羊泰勒虫病疫区羊体的青海血蜱成虫、若虫、幼虫同时叮咬健康羊,18 d时在试验羊体内发现羊泰勒虫,试验羊表现贫血、黄疸、稽留热、肩前淋巴结肿大等特征性症状,出现心包积液,肝、脾、肾肿胀及出血的典型病理变化.由此确定,甘肃省的羊泰勒虫是由青海血蜱传播的.     

麻点璃眼蜱的鉴定及部分生物学特性研究

1999-2000年3-9月份从甘肃省永靖县的绵羊、山羊体表采集蜱842只(雄虫453只,雌虫389只),经鉴定为麻点璃眼蜱(Hyalomma rufipes).该种蜱对山羊的侵害大于绵羊,一般寄生于羊后肢内侧、肛门周围和母羊外生殖器周围等无毛或毛稀少、毛很短的部位.经实验室人工饲养,证明该种蜱为二宿主蜱,饱血雌虫产卵前的生殖滞育期平均39.5 d,产卵期平均22.5 d,卵孵化平均27 d,幼虫从开始吸血到变为饱血若虫19.5 d,饱血若虫蜕皮约37 d;成虫活动季节为3-10月份,5-6月份为高峰期,羊在高峰期的感染率达100%.     

残缘璃眼蜱subolesin基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为研究残缘璃眼蜱subolesin基因的生物学特性以及寻找新的抗蜱和蜱传病疫苗候选抗原,根据GenBank上登录的小亚璃眼蜱subolesin基因核苷酸序列设计特异性引物,以残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱的饥饿成蜱cDNA为模板,扩增出subolesin基因的完整阅读框(ORF)。将残缘璃眼蜱subolesin基因的PCR产物经EcoRⅠ+NotⅠ双酶切后连接至表达载体pGEX-4T-1,把重组质粒pGEX-4T-1-subolesin导入感受态细胞BL21(DE3)中,在37℃、1mmol/L IPTG条件下诱导表达。利用SDS-PAGE分析subolesin基因的体外表达特征;用Western-blot分析Subolesin蛋白的反应原性。结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱subolesin基因的ORF长度分别为492、492、486bp,分别编码163、163、161个氨基酸。subolesin基因序列和推导的氨基酸序列的比对结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱与参考的小亚璃眼蜱的核苷酸序列同源性分别为98%、98%、89%,氨基酸序列同源性分别为98%、99%、93%。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,重组残缘璃眼蜱Subolesin蛋白的分子质量为45ku,纯化的subolesin重组抗原可与抗残缘璃眼蜱全蜱血清、残缘璃眼蜱唾液腺、卵巢血清有较强的反应原性。     

瑟氏泰勒虫与环形泰勒虫某些特性的比较研究

通过长角血蜱和残缘璃眼蜱的交互传递试验、虫体形态学观察及过氧化物酶等同工酶的分析，对瑟氏泰勒虫及环形泰勒虫作了比较研究。结果表明，长角血蜱只能传播瑟氏泰勒虫而不能传播环形泰勒虫；同样，残缘璃眼蜱只能传播环形泰勒虫而不能传播瑟氏泰勒虫。瑟氏泰勒虫以杆形和梨子形为主，其比例一般保持在６７％～９０％之间；而环形泰勒虫则主要以圆环形和卵圆形为主，占总数的７０％～８５％。经聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析表明，这两个种的过氧化物酶同工酶均有两条带，但瑟氏泰勒虫的迁移速度要比环形泰勒虫的明显的快。     

二十八种药物对亚洲璃眼蜱杀灭效果的观察

为筛选高效、低毒、广谱的灭蜱药物,采用体外浸渍法,测定了28种药物在推荐浓度下对亚洲璃眼蜱饱血若蜱的杀伤效果,观察处理后3d内蜱的死亡率和40d内的蜕皮率。结果显示,28种药物中噻虫啉、毒死蜱、乙基多杀菌素、苦参碱、乙螨唑、高效氯氟氰菊酯、螺虫乙酯和灭幼脲对亚洲璃眼蜱饱血若蜱具有较好的杀伤效果,蜕皮率分别为0、0、24.33%、33.7%、36.06%、45.45%、51.49%和57.58%,而对照组——蒸馏水处理组和未处理组的蜕皮率分别为96.67%和100%。Duncan’s差异显著性比较结果表明,上述这8种药物处理组与对照组之间存在极显著差异,特别是毒死蜱和噻虫啉在用药后第3天蜱的死亡率分别达到96.33%和48.33%。此外,其他药物处理组蜱的蜕皮率均高于60%。通过本试验,筛选获得例如乙基多杀菌素、苦参碱、噻虫啉等低毒环保且对亚洲璃眼蜱有较高杀伤效果的药物,为研制防控蜱的复方新制剂奠定了基础。     

麻点璃眼蜱生活史的研究

在实验室条件下 ,将麻点璃眼蜱 (Hyalommarufipes)幼蜱至若蜱置于牛体或兔体、成蜱置于羊体摄食 ;若蜱蜕化、饱血雌蜱产卵和孵化在 2 8℃、相对湿度约 80 %的培养箱中完成。在此条件下 ,对从甘肃省永靖县羊体获得的麻点璃眼蜱在实验室进行了生活史研究。试验证实 ,该种蜱为二宿主蜱 ,一个生活周期需要经过幼蜱、若蜱、成蜱和卵 4个发育阶段。幼蜱 5～ 7d饱血 ,蜕化为若蜱后不离开前一变态期蜱的寄生部位 ,继续在宿主体上叮咬吸血 ,经 14～ 2 4d若蜱饱血脱落。若蜱蜕化期为 18～ 63d ,平均 40 .5d。雌蜱饱血需 8～ 16d ,平均 12 .0d。雌蜱产卵前静止期 6～ 43d ,产卵期 16～ 2 9d ,平均 2 2 .5d。卵经 2 0～ 41d孵出幼蜱 ,平均 3 1.5d。该种蜱在实验室完成一个生活周期需要 91～ 2 2 6d     

小亚璃眼蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的边缘革蜱4D8基因序列设计1对引物,采用PCR技术自半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表达文库中扩增获得了4D8基因;将其连入pMD18-T载体,构建重组克隆载体pMD18-Hyaa4D8.测序分析表明,克隆的小亚璃眼蜱4D8基因与边缘革蜱4D8基因的核苷酸序列的同源性为89.2%.将此片段定向亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Hyaa4D8,表达并纯化重组蛋白,通过免疫印迹试验鉴定该重组蛋白的生物学活性.结果显示,该重组蛋白是分子质量为45ku的融合蛋白,且表达产物能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫兔血清识别.     

羊的大型巴贝虫未定种的形态学和致病性初步研究

用采自新疆羊体的半饱血血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)与小亚璃眼蜱(Hyalomma anatolicum)成虫感染1只除脾绵羊.感染后逐日做血片检查,在感染后第11d的血片上发现一大型巴贝虫(Babesia sp.).虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形虫体为主,双梨子形虫体大小为3.0-4.0 gm×1.1-2.1μm.在感染后第14 d,感染羊体温升至41.2℃.染虫率最高达到0.25%,之后逐渐下降.感染羊自然耐过.     

九种硬蜱成虫哈氏器的电镜扫描

用扫描电镜观察了分别属于扇头蜱属、牛蜱属、血蜱属、革蜱属和璃眼蜱属的镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)、微小牛蜱(Boo-philus microplus)、西藏血蜱(Haemaphysalis tibetensis)、微形血蜱(H.wellingtoni)、青海血蜱(H.qinghaiensis)、草原革蜱(Dermace-ntor nuttalli)、银盾革蜱(D.niveus)、麻点璃眼蜱(Hyalomma ruf-ipes)、亚东璃眼蜱(H.asiaticum)等9种硬蜱成虫的哈氏器。在这5个属间,哈氏器在囊孔形状、前窝的形状和深浅、感毛的数目、孔毛的位置和形状及长短、锥毛的位置、基盘的数目、远端毛的数目和位置上存在着区别。在同一属内,哈氏器结构也存在着区别。西藏血蜱、微形血蜱、青海血蜱的哈氏器在前窝形状、孔毛的长短和形状以及位置、锥毛的位置、远端毛的位置和数目上存在着区别。草原革蜱和银盾革蜱的哈氏器在前窝形状和深浅上存在着区别。麻点璃眼蜱和亚东璃眼蜱的哈氏器在锥毛的位置上存在着区别。     

甘肃省媒介硬蜱的种类与地理分布

采用布旗法与家畜体表捕捉法 ,在甘肃省 6个不同地理区划内的部分县、市、区采集硬蜱标本 ,共发现了 2 0种硬蜱 :河西走廊有草原革蜱 (Dermacentornuttalli)、银盾革蜱 (D .niveus)、亚洲璃眼蜱 (Hyalommaasiaticumasiaticum)、麻点璃眼蜱 (H .rufipes)、小亚璃眼蜱 (H .anatolicum )、亚东璃眼蜱 (H .asiaticum ) ;河西走廊南山地有草原革蜱、嗜驼璃眼蜱 (H .dromedarri)、小亚璃眼蜱、亚东璃眼蜱 ;河西荒漠高原有草原革蜱和残缘璃眼蜱 (H .detritum ) ;中部黄土高原有草原革蜱、森林革蜱 (D .silvarum )、日本血蜱 (H .japonica)、长角血蜱 (H .longicornis)、青海血蜱 (H .ginghaiensis)、卵形硬蜱 (Ixodesovatus) ;陇南山地有草原革蜱、长角血蜱、刻点血蜱 (H .puncta ta)、卵形硬蜱、全沟硬蜱 (I .persulcatus)、血红扇头蜱 (Rhipicephalussanguineus)、微小牛蜱(Boophilusmicroplus) ;甘南山地山原地区有草原革蜱、草原硬蜱 (I .crenulatus)、全沟硬蜱、钝跗硬蜱 (I .pomerantzevi)、青海血蜱、草原血蜱 (H .verticalis)。草原革蜱分布于甘肃省 6个地理区划 ,其他 19种硬蜱的分布具有明显的地理特征     

几种蜱MLP基因的表达及其表达产物反应原性的分析

通过对饥饿的长角血蜱雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,以期获得长角血蜱MLP基因全长cDNA序列。设计通用引物,采用PCR方法分别从青海血蜱、麻点璃眼蜱、森林革蜱、微小牛蜱及小亚璃眼蜱中对MLP基因完整的开放阅读框进行了扩增,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。结果表明,成功扩增了长角血蜱的MLP基因全长序列及多个蜱种的MLP基因开放阅读框序列,体外高效诱导表达了约39.2ku的不同蜱的MLP重组蛋白。Western-blot结果表明,长角血蜱的MLP重组蛋白具有很强的反应原性,且不同蜱的重组蛋白间具有很强的交叉反应性。     

七种药物对微小牛蜱的半数致死浓度测定

用浸渍法测定了楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、哒嗪酮、螨净 7种药物对未吸血的微小牛蜱 (Boophilusmicroplus)幼蜱、若蜱、成蜱及其饱血雌蜱的半数致死浓度(LC50 )。结果显示 ,所用药物中半数致死浓度最低的 3种药物是楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤。植物性杀虫剂楝素对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3.0 1～ 3.13、4 .37～ 4 .77、11.18～ 11.36、2 75 .5 0～ 2 76 .5 0mg/L ;植物性杀虫剂苦皮藤对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 4 .2 2～ 4 .4 2、10 .30～ 10 .5 0、82 .5 0～82 .70、6 35 .30～ 6 36 .70mg/L ;人工合成的除虫菊酯类的三氟氯氰菊酯对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 3.4 2～ 3.4 4、7.10～ 9.0 6、4 2 .30～ 4 2 .5 0、5 45 .5 0～5 46 .70mg/L。     

NSP-ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒 (FMDV)非结构蛋白 (NSP) 3ABC多肽作为抗原 ,建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验 (I ELISA)。通过对 336份正常牛血清、50 8份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和 58份豚鼠免疫血清的检测 ,确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明 ,该方法简易、快速 ,灵敏度比VIAA AGID高     

环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。     

川西北草地牛皮蝇蛆病的流行病学调查及防治

临床检查了牦牛和黄牛体内寄生的牛皮蝇蛆 ,其寄生率分别为 84.2 5 %和 70 .2 8% ,寄生强度分别为 18.3 2个和 2 .17个 ;剖杀检查牦牛 114头 ,寄生率为 10 0 % ,寄生强度为 71.66个。经鉴定 ,牛皮蝇的种类有牛皮蝇 (Hypodermabovis)、纹皮蝇 (H .lineatum )和中华皮蝇 (H .sinense) 3种。弄清了牛皮蝇各期幼虫在牛体内的寄生季节、寄生部位、移行动态、三期幼虫寄生方位、入土化蛹羽化规律、成蝇活动规律等。药物防治试验证明 ,Ivomec注射液和国产的阿福丁片均是杀灭牛皮蝇蛆的首选药物。     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA12 72 1株裂殖体表面抗原 (TaSP)基因的序列设计了 1对引物 ,用PCR扩增出该基因长为 393bp的高免疫原性区片段 (SBxp)。将扩增产物连接到 pGEM TEasy载体上 ,转化入大肠埃希氏菌JM 10 9中进行克隆。随后将重组质粒 pGEM SBxp和表达载体 pGEX 4T 1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后 ,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体 pGEX 4T 1 SBxp ,并将其转化到BL2 1宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后 ,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳和Westernblotting检测。结果 ,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达 ,其表达产物为分子质量 4 3ku的融合蛋白 ,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

西藏当雄牦牛皮蝇蛆病病原的分子分类鉴定

2011年在西藏当雄县感染皮蝇蛆牦牛的背部皮下收集到三期幼虫113个,首先进行了形态学鉴定,之后提取DNA,用特异性引物扩增COⅠ基因,并进行测序,与GenBank中的相关序列进行了同源性比较,建立了系统发育树。结果表明,西藏当雄县感染牦牛的皮蝇蛆为牛皮蝇蛆和中华皮蝇蛆。前者(85条)占样本总数(113)的75.22%,为西藏当雄牦牛皮蝇蛆病病原的优势虫种;COⅠ基因序列显示牛皮蝇和中华皮蝇的种间差异为10.8%～11.3%,同源性为88.7%～89.2%;牛皮蝇的株间差异为0.1%～0.6%,同源性为99.4%～99.9%,中华皮蝇的株间差异为0.1%～0.4%,同源性为99.6%～99.9%。说明COⅠ基因是牦牛皮蝇蛆病病原种类分子分类鉴定的可靠靶基因。     

捕食线虫性真菌生长特性的研究

对捕食线虫性真菌菌丝、分生孢子、厚垣孢子、捕食性结构的发育过程和特点及其在 0 .4g/L玉米粉琼脂固体培养基和液体培养基中的生长情况进行了研究。结果表明 ,捕食线虫性真菌菌丝在 0 .4 g/L玉米粉琼脂固体培养基上呈树枝形放射状生长 ,有的菌株还可以在 0 .4g/L 玉米粉液体培养基中呈絮状生长 ;分生孢子位于垂直的分生孢子梗顶端或近顶端部 ,多数出现在菌丝的生长后期 ;厚垣孢子在菌丝上呈插入性生长 ,在老的培养基中容易发现 ,且与捕食线虫性真菌的种类有关 ;捕食性结构在受到活线虫幼虫的刺激之后才会产生 ,而线虫虫卵与成虫并不能导致捕食性结构的产生。     

骆驼斯氏副柔线虫病传播媒介的筛选与确定

对从内蒙古骆驼生活环境中采集到的24种蝇进行普通生物学剖检,并进一步用斯氏副柔线虫特异性引物ST1、ST2对蝇体内检获的幼虫进行分子生物学鉴定,以筛选与确定骆驼斯氏副柔线虫病的传播媒介。结果显示,在西方角蝇和截脉角蝇体内均发现了疑似斯氏副柔线虫幼虫,感染强度为1～22条/个,雌蝇与雄蝇感染强度差异不显著;幼虫长度为1.033～1.934mm;雄蝇的感染率为43.8%～48.0%,雌蝇的感染率为35.7%～46.2%。扩增得到的部分ITS序列(包括5.8S)与GenBank中登录的斯氏副柔线虫ITS序列同源性高达99.3%。基本确定了西方角蝇和截脉角蝇为斯氏副柔线虫病的传播媒介。