猪传染性胃肠炎病毒HN-2012分离株S基因的遗传变异分析及其真核表达

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HN-2012株的cDNA为模板,经克隆测序后,将得到的S基因序列及其推导的氨基酸序列与NCBI中不同来源的TGEV毒株的相应序列进行同源性和亲缘关系的比较分析,构建系统进化树进行遗传变异分析;然后将S基因亚克隆至真核表达载体pCAGGS-S-flag中,转染293T细胞进行表达,利用flag标签抗体进行Western-blot分析。结果显示,TGEV HN-2012株的S基因与其他毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.1%~99.1%和93.6%~95.2%,与H株的亲缘关系较近,与我国其他毒株的亲缘关系较远。Western-blot分析中可见大小约为160ku的目的条带,表明S基因成功在293T细胞中表达。本试验结果为深入研究TGEV S蛋白的生物学功能奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物,对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pMD 18-T载体上,分别获得了全长为817、851、8548、54 bp的全基因序列。序列分析结果表明,新疆毒株间的核苷酸同源性为97.8%~98.9%,氨基酸同源性为96.5%~98.7%,与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较,同源性为90.0%~99.4%;与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较,同源性为81.4%~99.3%。系统进化树分析表明,新疆株独立分支。     

猪源伪狂犬病病毒福建龙岩分离株的鉴定及其TK基因和gE基因的分子特征

从福建省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养等方法证实该病毒为伪狂犬病病毒(PRV)野毒株,并命名为Fujian-LY株。对其主要毒力基因TK和gE的分子特征和遗传进化关系进行分析,结果表明,Fujian-LY株TK基因与参考序列的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.5%~99.8%和98.1%~99.4%;gE基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.6%~99.8%和95.5%~99.3%。氨基酸多序列比对发现,Fujian-LY株TK基因在2个位点发生了独特性的氨基酸突变,即第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G。其中,第16位氨基酸突变导致TK蛋白ATP结合结构域由-G**G*GK-转变为-G**G*GR-。gE氨基酸序列最具特征性的变化是第48位和第496位各有1个天冬氨酸(D)的插入,该插入特征为PRV变异毒株的重要标志。遗传进化树分析结果表明,Fujian-LY株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的亲缘关系较近,属于近年来流行的PRV变异毒株,而与PRV经典株的亲缘关系相对较远。     

鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因的遗传变异分析

对鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果表明,PSH株S基因由3 504个核苷酸组成,编码1条由1 167个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由541和626个氨基酸残基组成。PSH株S蛋白切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸(RRFRR),与多数鸡传染性支气管炎病毒(IBV)切割识别位点相似(RRF/SRR)。与GenBank中其他冠状病毒毒株S基因的推导氨基酸序列相比较,PSH株与IBV参考毒株的同源性为79.3%~99.6%,而与其他冠状病毒包括火鸡蓝冠病病毒和SARS病毒的同源性均小于37.8%。表明,鸽源冠状病毒PSH株属于第3抗原群冠状病毒,且与IBV亲缘关系较近。     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组(S1-4)中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明:鸭呼肠孤病毒(DRV)与禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76.0%~77.1%和78.4%~79.6%,氨基酸同源性分别为89.5%~91.2%和91.6%~92.7%;而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60.3%~64.4%和2.7%~9.9%,氨基酸同源性分别为61.4%~62.0%和22.6%~26.7%;DRV和ARV抗原性存在差异。而DRV S12/S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90.0%、93.6%、87.9%~88.0%和93.1%,氨基酸同源性分别为97.1%、94.3%、95.7%~95.9%和93.7%。进化树分析表明,DRV与ARV形成不同的分支,DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因的克隆及其结构特征

参照GenBank中登录的TGEVS基因序列设计了 3对特异引物 ,经RT PCR扩增获得了TS株S基因的SⅠ、SⅡ和SⅢ 3个片段 ,其大小分别约为 12 6 2、2 36 8和 12 6 6bp。SⅠ、SⅡ和SⅢ片段经剪接后 ,可知TS株的S基因全长为 4 347nt ,共编码 14 4 9个氨基酸。对TS株与其他毒株的S基因序列进行比较发现 ,TS株与Miller株、FS72 2 / 70株、TGEVH株、96 1933株、TFI株均在 112 4～112 9位有 5′ ATGATA 3′六个碱基 ,而在Purdue株、TH 98株、NEB72 RT株和PRCV HOL87株中缺失 ;TS株与Miller株、FS72 2 / 70株、TFI株、Purdue株、96 1933株、TGEVH株、TH 98株、NEB72 RT株和PRCV HOL87株的核苷酸序列同源性分别为 99.6 %、98.9%、98.0 %、98.3%、95 .7%、99.3%、97.7%、98.3%和 97.5 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 99.2 %、98.4 %、97.7%、97.8%、94 .8%、98.6 %、97.2 %、97.7%和 97.0 % ;TS株S蛋白的推导氨基酸序列较Purdue株、TH 98株和NEB72 RT株多出 2个潜在的糖基化位点 ,共 34个。与不同毒株比较后 ,推测在TGEV的S蛋白中第 71位的Asp(D)与呼吸道嗜性有关 ,第 2 19位的Ala(A)与肠道嗜性有关     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段,并将其克隆至pGEM T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明,6个NDV分离株 HN基因片段长度均为1 704 bp,编码568个氨基酸;彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为 96.0%~99.8%和98.6%~100%,与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为 96.8%~98.4%;但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低,为88.2%~91.0%。     

犬瘟热病毒PS株的全基因组序列测定与遗传进化分析

对犬瘟热病毒(CDV)PS株基因组进行全基因组序列测定与分析,以阐明该毒株的基因特征与遗传进化情况。利用RT-PCR方法分段扩增PS株全基因组序列,分别将产物克隆入pMD18-T载体中并进行测序,将所测序列拼接获得CDV PS株的全基因组cDNA。用DNAStar软件比较PS株全基因组序列与国内外犬瘟热病毒疫苗株和野毒株全基因组序列的同源性,然后用Mega4.0软件进行系统进化分析。测序结果显示,PS株全基因组序列的长度为15 690nt,该基因组推导的某些氨基酸位点发生了突变。与GenBank中登录的国内外参考毒株的同源性比较结果显示,PS株基因组与MKY-KM08分离株的基因序列同源性高达97.9%,与其他毒株的同源性为93.0%～97.0%;与CDV3疫苗株和Onderstepoort疫苗株的同源性最低,分别为93.2%和93.0%。基于全基因组序列绘制的系统进化树表明,所有CDV分离株分为疫苗株和野毒株2支,PS株和MKY-KM08株位于同一支,属于亚洲1型。结果表明PS株为野毒株,其全基因组序列与MKY-KM08株的全基因组序列亲缘关系最近。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

猪非典型瘟病毒GX01-2018株全基因组分子特征的分析

猪非典型瘟病毒(APPV)被证实是新生仔猪先天性震颤的致病因子。为了解广西APPV流行毒株的分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增APPV阳性病料,经克隆、测序、拼接,获得1株APPV的全基因序列,遂被命名为GX01-2018株。结果显示,GX01-2018株基因组全长11 565 bp,包括一个编码3 635个氨基酸的阅读框(ORF)。同源性分析显示,GX01-2018株与国内代表毒株广西GX-CH_2016株、江西JX-JM01-2018A01株、广东China/GD-SD/2016株、广东GD株核苷酸序列的同源性分别为98.2%、92.9%、83.4%、90.8%。GX01-2018株与国外代表毒株美国000515株、德国Bavaria_S5/9株、奥地利AUT-2016_C株、荷兰NL1株核苷酸序列的同源性分别为87.8%、90.7%、90.5%、90.7%。上述国内外代表毒株间Npro、Erns、E2基因核苷酸序列的同源性分别为79.1%～97.2%、83.0%～98.4%、83.1%～96.8%。基于APPV全基因组以及E2、Npro、Erns基因核苷酸序列绘制遗传进化树,获得相似的进化树图。来自广西的GX01-2018株与欧洲型毒株位于一个分支,而同样来自广西的GX04/2017株与美洲型毒株位于另一个分支。表明APPV流行毒株具有遗传多样性,来自同一地区的流行毒株出现较大的遗传变异。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的 2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测 2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门 (Shimen)株进行了比较分析。结果显示 ,GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为 82 .1%和 82 .6 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 87.9%和 88.7% ;GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为 83.6 %和 84 .0 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 89.3%和 90 .1%。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

猪非典型瘟病毒的基因组特征分析及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

最近的研究表明,猪非典型瘟病毒(APPV)在我国猪群流行,并造成了严重的危害。本研究应用RT-PCR方法对APPV GD3株进行了全基因组扩增、测序,并进行了全基因组及其部分编码基因的遗传演化分析;根据APPV基因组编码的结构蛋白E2的基因序列,构建了APPV的荧光定量RT-PCR检测方法。APPV GD3株的全基因组序列与德国、美国、荷兰和西班牙毒株在不同的进化分支上,同源性为83.1%~83.4%;与中国毒株GD1、GD2和GD的同源性分别为99.5%、99.6%和83.4%。GD3株编码的E2、Npro和Erns基因与国内外现有毒株的同源性分别为83.1%~99.7%、80.2%~99.8%和81.9%~99.5%。本研究建立的荧光定量RTPCR检测方法特异性强、最低检测浓度为10 copes/L、操作简单、耗时短,具有良好的兽医临床应用前景。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳N蛋白基因的克隆与鉴定

根据文献已发表的猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)cDNA基因序列 ,设计和合成 1对引物 ,以TGEVTH 98强毒株基因组mRNA为模板 ,通过RTPCR技术扩增其N基因 ;将RTPCR产物按正确的阅读框架 (ORF)定向克隆到载体pProEXHTb上 ,重组质粒PHN转化进大肠埃希氏菌DH5α株 ,通过酶切分析及序列测定表明已成功获得了TGEVN基因的无性繁殖体系。TH 98强毒株的N基因与Purdue 115株、FS772 / 70株、TO14株、96193 3株及TFⅠ株的核苷酸序列的同源性分别为 99%、97%、97%、95 %和 96% ,氨基酸序列的同源性分别为 99%、97%、98%、96%和 97%。     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒(AVAV)内蒙古分离株(C-98株)总RNA,参考GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株S1基因序列设计了2对引物,应用RT-PCR技术扩增了病毒S1基因,将S1基因cDNA克隆到pGEM-T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV-YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示,AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高,达99.9%;与MDRV-YJL的同源性为99.3%,与弱毒疫苗株ARV-S1133的同源性也达97.9%;与ARV-138株的同源性最低,为81.2%。表明,AVAV C-98株与参考毒株的差异较小,与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly(I)/(C)诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列.序列分析表明该基因编码区长2118 bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性.通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL-N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近.北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49.5%～76.8%,氨基酸同源性为44.1%～61.6%.据此可以推断克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关.     

广东省猪生殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因的变异分析

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(ATCC VR 2332)基因序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF5和ORF6 基因的引物,利用RT PCR从广东省送检的5份病料中均分别扩增得到了大小约787、630 和550 bp的片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD 18 T载体并测序。应用DNAStar软件分析,并与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)、LV4.2.1 株的序列进行比较。结果显示,这5 个毒株与CH 1a、HB 1(sh)、BJ 4、ATCC VR 2332、疫苗株等毒株ORF3、ORF5、ORF6 的核苷酸同源性分别为87.2%~98.7%、85.4%~96.8%、91.8%~98.9%,推导的氨基酸同源性分别为84.6%~97.6%、84.5%~95.5%、94.8%~98.9%;而与LV4.2.1株的核苷酸同源性分别为56.1% ~58.3%、54.4%~57.0%、62.2%~64.4%,推导的氨基酸同源性分别为53.9%~56.7%、54.0%~57.0%、78.0%~80.3%。基因系统发育树表明,广东省流行的PRRSV 与HB 1(sh)株的亲缘关系比较近。