猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型(PCV2)经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次。BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞数量显著减少。裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变。结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感。     

猪圆环病毒2型套式PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪圆环病毒 2型 (PCV2 )的全基因组序列 ,设计了 2对引物 ,建立了检测PCV2的套式PCR方法。对该方法用序列分析、酶切等方法进行了鉴定。同时用该套式PCR方法对华南地区 2 87个猪场的 15 6 0份样品进行了检测 ,结果 ,983份为PCV2阳性 ,阳性率为6 3%。     

猪生殖与呼吸综合征病毒广东株ORF3和ORF5基因的克隆与分析

采用RT PCR方法扩增了猪生殖与呼吸综合征病毒广东株的糖蛋白基因ORF3、ORF5 ,并对其进行了克隆和序列分析。用Blast分析软件比较分析了其与VR 2 332株以及流行的欧洲株之间的同源性 ,并对其编码氨基酸序列的分子质量、等电点、穿膜区、糖基化位点进行了分析。结果显示 ,PRRSV广东株ORF3与美洲株的同源性达 90 % ,而与欧洲株只是在 318～ 393bp、5 0 2～ 6 97bp之间有 77%左右的同源性 ;ORF5与美洲株的同源性为 88% ,与欧洲株仅在 133～ 2 0 9bp区间有 77%左右的同源性。     

用PCR检测鸡新城疫病毒的初步试验

用ＰＣＲ检测鸡新城疫病毒的初步试验宋长绪，刘福安（华南农业大学广州５１０６４２）鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）的检测在临床诊断和口岸检疫等方面具有重要意义。尤其是在口岸检疫中，要求准确而快速，因此目前常用的血凝（ＨＡ）和血凝抑制（ＨＩ）试验远不能满足这方面的...     

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。     

华南五省区猪增生性肠炎的血清学调查

采用ELISA方法对采自福建、广东、广西、湖南、湖北5省区22个猪场的1 100份血清样品进行了猪增生性肠炎抗体检测。结果,在被检的22个猪场中猪增生性肠炎抗体全部阳性;但不同阶段的阳性率不同,3~4周龄和8~10周龄猪的阳性率较低,一般低于50%,从13周龄开始阳性率增加,18和24周龄阳性率最高达90%,后备母猪和母猪阳性率高达50%~100%。结果表明,猪增生性肠炎已成为华南地区集约化养猪场的一种高发病。     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒 2型 (PCV 2 )的ORF1基因序列 ,设计合成了 1对引物 ,对PCV 2广东株 (GD)ORF1基因进行PCR扩增 ,将扩增的ORF1基因克隆入 pMD 18 T载体 ,获得的重组质粒命名为 pMD ORF1。将ORF1的KpnⅠ和XbaⅠ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/ gⅢC得到重组子 ,命名为 pBAD/ gⅢ ORF1。序列分析表明 ,克隆的ORF1与德国分离株AF2 0 1897核苷酸序列的同源性高达 99.5 % ;与其他PCV 2株的核苷酸序列同源性为 92 .1%～99.9% ,推导的氨基酸序列同源性为 90 .2 %～ 99.5 %。同时 ,测序结果表明 ,克隆的ORF1准确插入了 pBAD/ gⅢC的多克隆位点 ,未改变读码框。用L 阿拉伯糖诱导表达 ,收集菌液进行SDS PAGE和Western blotting分析 ,结果表明PCV 2ORF1在pBAD/ gⅢC中获得了高效融合表达 ,其表达蛋白的分子质量约为 4 1ku。     

基于TaqMan探针的猪圆环病毒1型实时荧光定量 PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因,构建了重组质粒pMD-ORF2并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测PCV1的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的检测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL;对起始浓度为1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%.表明,此方法具有良好的准确性和重现性.     

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测标准阳性模板的构建

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因,将构建的重组质粒pMD-ORF2作为PCV2实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测的标准阳性模板,并对该模板进行了酶切及测序鉴定。结果显示,此模板特异性强,稳定性好,-20℃保存20 d无显著变化;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的pMD-ORF2标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105和0.987×104,其变异系数分别为2.527%、2.067%和2.092%。表明,以此模板进行FQ-PCR具有良好的准确性和重现性。该模板的检测线性范围宽,当稀释度为1.0×109~1.0×105拷贝/μL时,相关系数r=-0.989。     

广东省猪生殖与呼吸综合征病毒主要结构蛋白基因的变异分析

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(ATCC VR 2332)基因序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF5和ORF6 基因的引物,利用RT PCR从广东省送检的5份病料中均分别扩增得到了大小约787、630 和550 bp的片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD 18 T载体并测序。应用DNAStar软件分析,并与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)、LV4.2.1 株的序列进行比较。结果显示,这5 个毒株与CH 1a、HB 1(sh)、BJ 4、ATCC VR 2332、疫苗株等毒株ORF3、ORF5、ORF6 的核苷酸同源性分别为87.2%~98.7%、85.4%~96.8%、91.8%~98.9%,推导的氨基酸同源性分别为84.6%~97.6%、84.5%~95.5%、94.8%~98.9%;而与LV4.2.1株的核苷酸同源性分别为56.1% ~58.3%、54.4%~57.0%、62.2%~64.4%,推导的氨基酸同源性分别为53.9%~56.7%、54.0%~57.0%、78.0%~80.3%。基因系统发育树表明,广东省流行的PRRSV 与HB 1(sh)株的亲缘关系比较近。