四川省美姑县羊蓝舌病病原分离鉴定

对采自四川省美姑县的疑似蓝舌病绵羊、山羊血清14份,全血13份,进行蓝舌病抗原、抗体检测和病毒分离鉴定.结果在10份血清样品中检测到蓝舌病抗体,在13份全血样品中分离到2株病毒,经蓝舌病病毒群、血清型鉴定,分离毒株的血清型为BTV-1型.     

广东某奶牛场蓝舌病病毒分离株血清型与基因型的鉴定

为了解广东省蓝舌病病毒(BTV)流行的主要血清型及基因型,于2013-2014年在广东省汕头市某奶牛场进行了蓝舌病病毒监测及病毒分离,同时扩增了分离株的VP7和VP2基因,采用生物信息学软件进行序列分析并构建系统进化树。结果显示,从64份BTV抗体阳性牛、山羊血液中分离到16株BTV,主要血清型为BTV-2、BTV-4、BTV-12和BTV-16。遗传进化分析表明,其中3个BTV-2分离株与我国台湾(AY493687)、日本(AB686224)、澳大利亚(JQ240322)的分离毒株的遗传关系较近;8个BTV-4分离株与1997年分离自我国云南的毒株(JX560414)同属一个进化分支;2个BTV-12分离株与印度毒株(KC662613)位于同一分支;4个BTV-16分离株与日本毒株(AB686225和AB686226)同在一个大分支上。本研究结果为丰富我国蓝舌病的流行病学资料和疫苗研制奠定了基础。     

国外蓝舌病的研究和进展

蓝舌病是绵羊、牛、山羊和许多野生反刍类动物(如鹿和其他单蹄兽等)的虫媒病毒传染病。马、狗、猪、猫不感染蓝舌病(Howell,1963)。牛往往成隐性感染,长期带毒。 本病在非洲各国流行。美国也呈地方流行性,存在于南方一些州,其他如日本、巴基斯坦、葡萄牙都报告有此病发生,近几年,伊拉克(1978)、澳大利亚曾报告出现蓝舌病;澳大利亚分离出新型蓝舌病病毒(St.George等,1978)。 病毒的特征和传播方式 (一)蓝舌病病毒的特性 蓝舌病病毒是双股RNA病毒。Borden等人建议将虫媒的双     

蓝舌病的流行现状

论述了蓝舌病在全球(包括欧洲、中东、北非及其他地区)的流行现状,并分析了蓝舌病的流行原因,另外对该病流行病学研究的新方法进行了描述。提出,应加强对疫区原有血清型及新血清型毒株的流行病学监测及对健康动物实施适当免疫。     

新血清型流行性出血病病毒荧光定量qRT-PCR与RT-PCR检测方法的建立及应用

流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒。目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,2018年笔者在云南芒市新分离到1株新血清型EHDV毒株(YNDH/V079/2018),但尚缺乏该血清型的特异性检测方法。本研究建立了新血清型EHDV核酸检测的实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和RT-PCR方法。试验结果显示,建立的两种方法均具有良好的特异性与灵敏度,与另外7种血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)和阴性对照均无交叉反应。对病毒核酸的检测下限分别达到10 copies/μL(qRT-PCR)与10~2copies/μL(RT-PCR)。临床样品检测显示,qRT-PCR能在动物感染EHDV早期检测鉴定出病毒,更适合应用于检测病毒载量较低的血液样品。RT-PCR的扩增产物可以胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息,两种方法辅助使用,为新血清型EHDV的早期快速诊断、流行病学调查和试验研究等提供了有效的技术方法。     

蓝舌病病毒灭活抗原的研究

蓝舌病是危害养羊业最严重的一种世界性传染病。其病原为蓝舌病病毒,属于呼肠弧病毒科环状病毒属。截止目前该病毒发现22个血清型。这种多型性对诊断和防制本病带来一定的困难。经过多年的研究,许多国家在本病的诊断方面取得了显著成绩。多种血清学诊断方法研制成功,群特异性(group-specificity) 方法(琼脂扩散试验、改良补体结合试验、免疫荧光方法、酶联免疫吸附方法)和型特异性(type—specificity)方法(中和试验、红血球凝集抑制试验等)在生产中得到推广应用。但上述方法中有时使用活的病毒,对无蓝舌病的国家是一种潜在性的危险。为此,开展了病毒免疫活性的灭活方法的研究。本文介绍了几种灭活方法对比实验内容,并研制成一种可供诊断用的灭活病毒,为制     

蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。     

绵羊蓝舌病病毒的形态学观察

云南省发现蓝舌病(Bluetongue discase)并分离获得蓝舌病病毒(Blue-tonguevirus,BTV)后,曾对该病毒进行过电子显微镜检查,但未见到典型病毒颗粒。本次实验病毒试样经浓缩与纯化处理,首次获得典型的、结构清晰的BTV形态照片。     

蓝舌病在世界的分布

1909年肯尼亚绵羊发生蓝舌病后,在加纳和尼日利亚进口的美利奴绵羊,摩洛哥,葡萄牙及西班牙饲养的美利奴绵羊,塞浦路斯进口的绵羊和地方品种先后发生本病。 据最近报道,目前全世界分离的蓝舌病病毒已有24个血清型,其中非洲有16个型美国有5个型,印度、塞浦路斯和巴基斯坦各有1个型。     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

帕利亚姆病毒血清型特异性RT-PCR检测方法的建立

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)包含多种血清型病毒,我国存在Chuzan virus(CHUV)、Bunyip Creek virus (BCV)和D'Aguilar virus (DAV)三种血清型PALV毒株的流行,目前尚无PALV血清型特异性RT-PCR检测方法的报道。本研究根据获取的中国CHUV、BAV和DAV这三种PALV血清型毒株的Seg-2序列,设计合成了3对特异性引物,建立了PALV血清型特异性一步法RT-PCR检测方法。灵敏度试验结果显示,CHUV、BCV和DAV血清型鉴定引物可分别检测到1.3×10~2 copies、8.0×10~2 copies和5.5×10~2 copies的核酸;特异性试验结果表明,本研究建立的PALV血清型特异性检测方法与蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、非洲马瘟病毒(ASHV)均无交叉反应。本研究建立的PALV血清型特异性RT-PCR检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,为开展PALV的诊断与流行病学监测提供了有效的技术手段。     

蓝舌病毒14型的分离与鉴定

为了解我国新疆地区羊蓝舌病的流行情况,对某羊场疑似发生蓝舌病的羊病料进行了采集,并进行病毒分离和鉴定。应用间接ELISA试剂盒检测血清抗体,抗凝血样品接种敏感的BHK21细胞进行连续盲传,对细胞病变呈阳性的样品进行间接免疫荧光鉴定,同时针对VP7片段和VP2片段设计引物进行RT-PCR检测鉴定,并对其L2基因进行系统发育树分析。结果显示,血清中BTV抗体检测均为阳性,接种BHK21细胞后均产生了特异性细胞病变,并与FITC标记的抗BTV单抗特异性结合,针对VP7扩增出1 156 bp片段,针对VP2分别扩增出850 bp和1 581 bp片段,经测序和序列分析确定为BTV-14型。结果表明,我国新疆地区存在蓝舌病毒14型,这也是我国境内首次分离到蓝舌病毒14型,为进一步防控我国蓝舌病疫情提供了科学依据。     

127株不同来源的猪丹毒杆菌的分型鉴定

目前,按照Kuosera的分型系统,根据菌细胞壁的可溶性耐热抗原,将猪丹毒杆菌分为27个血清型(含亚型),命名为1、1a、1b、2、2a、2b、3………22型和N型。最近,徐克勤等(1984)又报告一种由健康猪扁桃体分离的不同于(国际标准血清型的新株,初步定为23血清型。我们用国际分型方法,通过琼脂扩散试验对127株不同来源的猪丹毒杆菌作了血清学分型,现将结果报告如下。     

新疆牛蓝舌病毒的分离和鉴定

为监测新疆地区自然环境中蓝舌病流行情况,并分离蓝舌病毒(BTV),本研究在巴州尉犁县设置10头牛为哨兵动物,自2016年5月~11月期间每周采集哨兵动物的血清和抗凝血,各采集了280份。用竞争ELISA(c-ELISA)方法对所有血清样本进行BTV抗体检测,并将所有抗凝血样本接种于C6/36、BHK21和Vero细胞,盲传5代,有4份细胞出现病变,对这些病变细胞液进行BTV抗原捕获ELISA(Ac-ELISA)检测、BTV血清型群特异片段VP7基因PCR鉴定和免疫电镜观察。结果显示,所有细胞病变样本的BTV抗原检测均为阳性;经RT-PCR扩增,在1 156 bp处均获得目的基因片段;免疫电镜观察到蓝舌病毒粒子。上述结果表明,本研究在新疆首次成功分离到了牛源BTV。     

流行性出血病病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立流行性出血病病毒(EHDV)群特异性核酸检测方法,本研究根据GenBank中登录的EHDV毒株内衣壳结构蛋白VP7基因的保守区,设计并合成1对特异性引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感度和临床样品的检测试验。结果表明,该方法能特异性地检出不同地区分离的不同血清型EHDV,而对蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)无交叉反应,具有较好的特异性;不同血清型的EHDV最低检出量级为1×10~2copies/uL。同时,该方法能有效地从临床抗凝血样品中检测出EHDV核酸,与病毒分离试验结果进行比较,符合率为100%。说明所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于EHDV的快速检测、流行病学调查和试验研究。     

鉴别蓝舌病病毒血清29型RT-PCR与qRT-PCR方法的建立与应用

为建立快速鉴别蓝舌病病毒血清29型(BTV-29)的方法,根据BTV-29型毒株基因节段2(Seg-2)的序列特征,分别设计用于RT-PCR与qRT-PCR方法的特异性引物与TaqMan探针,通过试验确定其敏感性,用BTV-1～BTV-24等核酸作为对照评价其特异性.对BTV-29感染动物血液样本中的病毒核酸进行监测,...     

中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离与鉴定

为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过"鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞"接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示,病毒粒子无囊膜,直径约80 nm,表面分布有纤突。血清中和试验表明,分离的病毒为蓝舌病病毒血清5型(BTV-5),使用抗BTV-5型的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光染色,进一步证实分离毒株为BTV-5型。设计特异性引物对V084/YN/2012毒株的Segment 2 (Seg-2)与Segment 3 (Seg-3)的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序,序列分析结果显示,V084/YN/2012与BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)的Seg-2核酸序列相似度为95.4%,在系统发育树上聚为一簇,属Seg-2基因E型;Seg-3在系统发生树上属Eastern topotype型,与中国BTV-4型YTS4毒株聚为一簇,核酸序列相似度高达97.5%。病毒蚀斑与增殖曲线测定试验表明,V084/YN/2012与实验室保存的BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)在BHK21细胞上可形成形态大小相近的病毒蚀斑,二者在BHK21细胞上的增殖特性也基本一致。本研究确认了BTV-5型V084/YN/2012毒株在我国的分离,掌握了病毒Seg-2与Seg-3基因的遗传特征以及病毒在BHK21细胞上的增殖特性。研究结果为进一步开展中国BTV-5型的基因组测序、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

免疫酶技术证实:国内的猪传染性胃肠炎病毒与比利时的CLV在血清学上相一致

1979年黄均健等用免疫荧光、中和试验、酶免疫试验和猪体交互保护试验等发现国内猪传染性胃肠炎病毒(简称TGE华株)与国外TGE M株、SH株和TO株不同,初步认为TGE华株可能是TGE新的血清型,但也不排除是一个新的冠状病毒的可能。M.Pensaert在1978年报道比利时发现一个与TGE不同的CLV(Corana-like virus)。我们用比利时的CLV抗血清制成的酶标记抗体染上了我国的TGE华株。现报告如下。     

蓝舌病病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

以纯化的蓝舌病病毒(BTV)11型VP7免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,借助间接ELISA筛选,获得了3株分泌抗BTV11 VP7的群特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为C12D9、B4 F3、E1 A7.这3株杂交瘤细胞株连续传代3个月再经液氮冻存6个月后复苏培养,仍能稳定分泌特异性McAb.3株McAb均具有ELISA特性和免疫沉淀特性,其中C12D9株上清液的ELISA效价为1256,腹水的ELISA效价为10-6.亚类鉴定,C12D9株为小鼠IgG1,B4F3、E1 A7为IgG2a和IgG2b.琼脂免疫扩散试验和间接ELISA试验表明,这3株均与BTV11型VP7发生特异性反应,为BTV群特异性McAb.     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。