四种猪呼吸道疾病综合征病原多重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)和猪肺炎支原体(M.hyo)的多重PCR方法,分别针对PRRSV的ORF1a基因、PCV2的ORF2基因、APP的OMLA基因和M.hyo的P46基因的保守区域设计4对特异性引物,优化反应体系及条件,建立了可同时扩增PRRSV(225bp)、PCV2(337bp)、APP(107bp)、M.hyo(176bp)相应基因的四重PCR方法。结果显示,该方法能单管同时特异地鉴别检测PRRSV、PCV2、APP、M.hyo 4种病原体,对猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌、猪呼吸道冠状病毒、猪流感病毒、猪细环病毒及猪细小病毒等无特异性扩增,说明该PCR具有良好的特异性;方法的灵敏度分别为195、272、241、321pg/μL。应用该方法对重庆市的61份样品进行检测,其中PRRSV、PCV2、APP、M.hyo的阳性率分别为22.9%(14/61)、18.0%(11/61)、8.2%(5/61)和18.0%(11/61)。该方法的建立为临床上4个病原的快速鉴别诊断提供了有力的技术手段。     

GeXP多重基因表达分析系统及其应用

介绍了GeXP多重基因表达分析系统图的基本原理,重点阐述了该系统在多重基因表达分析和病毒检测方面的应用,并对该系统在病毒检测方面的应用前景进行了展望。     

猪瘟病毒NASBA-ELISA检测方法的建立与应用

为建立猪瘟病毒NASBA-ELISA检测方法,以猪瘟病毒(CSFV)E2基因为研究对象,利用Prim-er 5.0和Blastn生物软件,设计并合成了特异的核酸序列依赖扩增(NASBA)引物和探针。经条件优化,确定的最佳扩增反应条件为42℃,反应1.5h。临床检测结果显示,用该方法可特异地扩增CSFV E2基因约155bp的目的片段,而对TGEV、PRRSV、PCV2、PPV、PEDV、APP和PK-15正常细胞等核酸的检测均为阴性,可最低检出1×100～1×101 copies/μL,其灵敏度比RT-PCR略高。应用该方法对采自重庆部分地区猪场的125份样品进行了检测;结果,猪瘟病毒阳性检出率为5.6%,NASBA-ELISA法与RT-PCR法的检出符合率为94.4%。结果表明,NASBA-ELISA方法可应用于CSFV的快速鉴别检测。     

迟缓爱德华氏菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感检测迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的方法,本研究根据E.Tarda的促旋酶B亚单位基因(gyr B)保守区设计特异性引物和Taq Man探针,并优化检测反应条件,建立了E.tarda的Taq Man实时荧光PCR检测方法。结果显示,该方法仅对E.tarda的靶基因扩增呈阳性,而对创伤弧菌、福氏志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核增生性李斯特菌、肠炎沙门菌、溶藻弧菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌等相关致病菌检测结果均为阴性,特异性良好;该方法对E.tarda检测的灵敏度为20 CFU/m L;重复性试验表明,该方法的变异系数在0.95%~2.44%之间,具有良好的重复性。本研究结果表明,建立的E.tarda Taq Man实时荧光PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于E.tarda检疫、疫情监测及流行病学调查。     

家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测家畜嗜衣原体,选取家畜嗜衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的高度保守区域,设计特异性引物和探针,通过对反应条件的优化,建立家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的最低检测限为2.8×10copies/μL,在2.8×102~2.8×106 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其标准曲线方程为y=-3.281 5x+41.396,线性相关系数r2=0.999 4,扩增效率为101.7%;该方法可特异性检测家畜嗜衣原体,对肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体等6种动物衣原体无交叉反应,特异性好;其批间重复试验和批内重复试验的变异系数分别为0.170 2%~0.467 2%、0.331 4%~2.796%,重复性良好。采用本试验建立的方法与OIE推荐的方法进行比较,二者的结果表现出良好的符合率。该方法的建立为家畜嗜衣原体的早期检测和流行病学调查提供了有效的检测手段。     

蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。     

副猪嗜血杆菌LAMP检测方法的建立

为建立快速鉴别检测副猪嗜血杆菌的方法,根据Gen Bank中公布的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因设计环介导等温扩增(LAMP)引物,利用Loopamp Realtime Turbidimeter LA-320c仪对反应体系和条件进行优化,建立了检测副猪嗜血杆菌的LAMP方法。结果显示,该方法可在65℃下反应15 min实现肉眼可视化直接判定结果。该方法仅对副猪嗜血杆菌有特异扩增,对胸膜肺炎放线杆菌、肠炎沙门菌等其他10种相关病原菌均无特异性扩增,表明特异性好,且具有较好的重复性及稳定性。其检测的灵敏度为0.175 fg/L,高于PCR方法1×10~4倍。对94份临床发病猪的鼻拭子样品平行检测结果显示,LAMP方法与NY/T 2417—2013标准中的方法间的符合率为96.8%。本方法为基层和口岸快速鉴别诊断副猪嗜血杆菌病提供了新的技术手段。