产后奶牛子宫黏液中微生物的分离鉴定及与黏液性状的关系

选择产后荷斯坦奶牛18头,以产后第21天的黏液性状评分和中性粒细胞计数为基础,将其分为健康组9头,亚临床子宫内膜炎组3头和临床子宫内膜炎组6头。通过对黏液中细菌的分离培养和测序,检测产后奶牛不同时间、不同子宫状态下子宫黏液中细菌的种类和数量,并分析了细菌种类、数量与产后时间及黏液性状的关系。试验表明,在健康组和患病组奶牛子宫内共分离到407株纯菌,经测序后发现其分别属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门的25种细菌,其中大肠杆菌、芽胞杆菌、葡萄球菌和希瓦菌的分离率较高,分别为44.14%、19.31%、6.21%和4.83%;蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌等只出现在健康牛子宫,克雷伯菌、不动杆菌、志贺菌、肾棒状杆菌、绵羊创伤球菌只出现在患子宫内膜炎的奶牛子宫。黏稠且不透明黏液中的分离菌数为98株,显著多于分离菌为37株的半透明、白色脓性黏液及分离菌为10株的透明、偶带白丝的黏液;其中产后第35天菌株分离数量和黏稠黏液数量最多,在黏稠型黏液中共分离出41株纯菌,占细菌分离总数的74.56%,绵羊创伤球菌、志贺菌、表皮葡萄球菌、不动杆菌等只从黏稠型黏液中分离到;产后第49~56天,细菌分离数量及黏稠型黏液数量较产后第35天逐渐减少。结果表明,大肠杆菌是感染产后奶牛子宫的主要微生物,奶牛产后子宫感染细菌数量越多黏液脓性越高,并且奶牛产生子宫内膜炎及脓性黏液可能与不动杆菌、绵羊创伤球菌、志贺菌等病原菌感染有关。     

草豆蔻有效部位对奶牛乳腺炎病原菌的抗菌活性研究

采用琼脂平板2倍稀释法测定了草豆蔻水提物、醇提物、醇-水提取物、挥发油4个活性部位对15个不同种属120株奶牛乳腺炎病原菌的最低抑菌浓度,用SPSS17.0软件中单因素方差分析法比较分析了4个活性部位分别对金黄色葡萄球菌、鲁氏不动杆菌和芽孢杆菌等11种菌株的抑菌活性的强弱;采用小鼠全身感染模型分析了草豆蔻油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体内抗菌活性。结果显示,草豆蔻4个活性部位对受试菌有不同程度的体外抗菌活性,且对革兰氏阳性菌的抗菌活性较对革兰氏阴性菌的活性强;在4个活性部位中,以挥发油的体外抗菌活性最强,除对4株单胞菌和7株大肠杆菌无抑菌活性外,对其余109株受试菌均有较强的活性,对革兰氏阳性菌的MIC50和MIC90分别为0.94～1.87mg/mL和0.47～1.87mg/mL,对革兰氏阴性菌的MIC50和MIC90均为0.47～29.92mg/mL。草豆蔻油在体内对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠和大肠杆菌感染模型小鼠有强的保护作用。高、中、低3个剂量对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的保护率分别为100%、90%、80%,对大肠杆菌感染模型小鼠的保护率分别为100%、90%、40%,呈明显量效关系。结果表明,草豆蔻挥发油是中药草豆蔻对奶牛乳腺炎病原菌的抗菌活性物质,可用于奶牛乳腺炎等感染性疾病的防治和食品防腐剂的开发。     

耐药基因cfr和optrA在猪源葡萄球菌的流行特征

为了解多重耐药基因cfr、optrA在猪源葡萄球菌中的流行分布,对来自广东省河源市和上海市3个猪场的280份鼻腔拭子样品,使用氟苯尼考(10μg/mL)甘露醇平板进行细菌分离,PCR检测cfr和optrA耐药基因,并通过gap基因进行菌种鉴定,采用琼脂稀释法对16种常用抗菌药物进行药敏试验。结果显示,本研究共分离获得38株葡萄球菌(分离率为13.57%),包括25株cfr阳性菌株(检出率为8.93%)和15株optrA阳性菌株(检出率为5.36%),其中2株葡萄球菌同时检出cfr及optrA基因。gap基因鉴定表明,15株optrA阳性葡萄球菌均为松鼠葡萄球菌,23株cfr阳性葡萄球菌成功分为4个不同葡萄球菌亚种,包括12株松鼠葡萄球菌、8株腐生葡萄球菌、2株马胃葡萄球菌及1株科氏葡萄球菌。药敏结果显示,38株cfr/optrA葡萄球菌均为多重耐药菌株,均对氟苯尼考、克林霉素和泰妙菌素耐药,且对部分药物表现出较高耐药率,如沃尼妙林(94.7%)、氨苄西林(92.0%)及四环素(89.5%),但所有菌株对万古霉素敏感。对比在不同生长阶段分离葡萄球菌中cfr及optrA的检出率,cfr和optrA基因主要流行于育肥猪。结果表明,3个猪场葡萄球菌cfr和optrA的检出率高,耐药情况严重,应加强抗菌药物在养殖过程中规范使用以减缓耐药性的产生和传播。     

四川省山羊皮下脓肿的流行病学调查及病原体分析

为调查达州、广安、攀枝花、巴中、资阳等四川省主要山羊产业区内的山羊皮下脓肿病的流行病学和致病病原,并对临床分离菌进行药物敏感性评价,以指导合理使用抗生素。在厌氧和常规培养条件下从临床病例中分离细菌,结合细菌的菌落形态和细菌生化特性分析,通过16Sr RNA基因序列分析进行细菌鉴定;测定分离菌的半数致死量(LD50)以判定其毒力强弱;使用CLSI推荐的K-B法进行药敏试验。结果表明,该病以1周岁左右的母山羊在春秋季发病为主,发病率为8.36%~11.27%,平均发病率为9.44%;分离的主要致病菌是伪结核棒状杆菌和金黄色葡萄球菌;其中伪结核棒状杆菌xw2株的LD50为107.5CFU/m L,金黄色葡萄球菌xj5株的LD50为109.7CFU/m L;药敏试验发现这两种分离菌的耐药现象比较普遍,对青霉素和庆大霉素的耐药现象比较严重,但20株伪结核棒状杆菌菌株对环丙沙星、利福平、头孢噻污的敏感率均≥85.00%,14株金黄色葡萄球菌菌株对氨苄西林、左氧氟沙星、利福平的敏感率均≥85.71%。     

猪小肠集合淋巴结菌群的特点及其鉴定

为对猪小肠集合淋巴结黏膜处的菌群构成进行鉴定和分析,采集20头自然饲喂猪的小肠集合淋巴结回肠黏膜段,对细菌进行分离培养并通过16SrDNA测序鉴定菌种。结果发现,从猪小肠集合淋巴结中共分离到43株细菌,其中,大肠杆菌的检出率最高,为90.00%;枯草芽胞杆菌次之,为35.00%;蜡样芽胞杆菌为15.00%,地衣芽胞杆菌、巴氏杆菌均为10.00%,短小芽胞杆菌等为5.00%。而其他肠黏膜处的菌群则有所不同,回肠黏膜段共分离到8株细菌,分别为大肠杆菌(71.43%)、克雷伯菌(42.85%)、猪链球菌(28.57%)、奇异变形杆菌(14.28%)、嗜水气单胞菌(14.28%)等。此外,地衣芽胞杆菌仅在小肠集合淋巴结中被检出,检出率为14.28%。结果表明,大肠杆菌是猪小肠集合淋巴结黏膜处的优势菌群,枯草芽胞杆菌在猪小肠集合淋巴结黏膜大量存在,地衣芽胞杆菌仅存在于猪小肠集合淋巴结黏膜中,三者可作为靶向小肠集合淋巴结细菌活载体口服疫苗的载体。     

红茂草生物碱抑菌活性的测定

用醇提法提取红茂草生物碱,经石英色谱柱层析分离、结晶后测定了红茂草生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、粪肠球菌的体外最小抑菌浓度(MIC)、抑菌率和半数抑菌浓度(IC50)。结果显示,红茂草生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、粪肠球菌的MIC分别是0.22、0.18、0.18、0.30mg/mL;对这4种供试菌的IC50分别是0.180 7、0.140 70、.140 70、.260 5 mg/mL。表明,红茂草生物碱对这4种细菌具有明显的抑制作用。     

野生动物园不同源性VRE耐药性及REP-PCR分型研究

为了解福州市野生动物园内不同源性耐万古霉素肠球菌的耐药现状及亲缘情况,进而指导兽医临床合理用药,并对控制耐药性传播提供理论依据。用微量肉汤法对6种抗生素进行药敏试验,PCR法检测VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因,并采用重复基因外回文序列PCR分析技术(REP-PCR),对分离自不同源性的耐万古霉素肠球菌进行基因多样性研究,比较菌株之间的亲缘关系。结果显示,福州市动物园内不同源性肠球菌分离到VRE共41株,耐药率高达100%,其中红霉素(100%)、土霉素(97.58%)和氯霉素(86.67%)耐药率最高;氨苄西林和万古霉素敏感率分别为92.12%和84.85%;万古霉素相关耐药基因VanA检出率为4.88%,VanB基因检出率为17.07%,VanC1基因检出率为31.71%,VanC2/C3基因检出率为39.02%;REP-PCR分型结果显示,不同来源的耐万古霉素肠球菌菌株大致可分为2~3个型,其中,分离自动物园环境的H2和H3、H1、H8和H9及分离自动物园不同动物的M9和NL6、MH5和MH8、M3、BM3和L6具有100%同源性。结果表明,动物园内肠球菌整体耐药情况较严重,耐药基因VanA、VanB、VanC1和VanC2/C3基因与多重耐药具有相关性;动物源性、环境源性和人员性VRE之间发现同源性100%的菌株,可能存在同一菌株的垂直克隆传播,不同源性VRE之间存在一定的流行病学相关性。     

湖南省猪源粪肠球菌毒力基因的检测及部分表型的测定

采用PCR方法对湖南省分离的42株粪肠球菌的8种毒力相关的基因即溶血素基因cylA、明胶酶基因gelE、表面蛋白基因esp、胶原蛋白黏附素基因ace、聚集物质基因asa1、心内膜炎有关的抗原基因efaA以及2个假定毒力相关基因EF3314、EF0591进行了检测,并用平板法测定了这些分离株的溶血性和明胶溶解性。结果显示,24株粪肠球菌分离株普遍存在EF3314基因,检出率为100%;其次是efaA基因,检出率为92.9%;其他毒力基因gelE、ace、asa1、cylA、esp、EF0591的检出率为分别为88.1%、59.5%、52.4%、54.8%、38.1%、4.76%。菌株在绵羊血琼脂平板上以α溶血为主,而在家兔血琼脂平板中以β溶血为主,家兔血琼脂平板溶血的检出率(95.2%)高于绵羊血琼脂平板溶血的检出率(88.1%)。HN45菌株属于cylA基因阳性菌株却表现为不溶血,而19株cylA基因阴性菌株中只有YZ28菌株在家兔血琼脂平板上表现不溶血,HH57菌株在绵羊血琼脂平板上表现不溶血。5株gelE基因阴性分离株只有2株不分解明胶,37株gelE基因阳性分离株中,有32株分解明胶,5株gelE基因阳性菌株不能分解明胶。结果表明,这42株粪肠球菌中每株菌最少携带1个毒力因子基因,有些菌株最多携带7个毒力因子基因;菌株的溶血与明胶溶解的基因型和表现型并非完全一致。     

一株鸭源巴氏杆菌强毒株的分离鉴定及致病性研究

为确定导致山东某地区种鸭发病的病原,从病鸭肝、心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定为禽多杀性巴氏杆菌。致病性试验结果表明,1.3×109CFU/m的菌液10倍系列稀释后,感染20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭,该分离菌对20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭的半数致死量分别为10-4.5CFU/mL、10-5.3CFU/mL;死亡雏鸡(鸭)的剖检病变与发病鸭类似并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对头孢曲松、氨苄西林、阿莫西林、环丙沙星、卡那霉素等较为敏感。     

猪持续性萎缩性鼻炎病因的确定

湖北省某大型养猪场下属的5个商品猪场育成猪发生了严重的持续性萎缩性鼻炎,临床发病率在A场为5.5％(60/1084),B场15.7％(95/607),C场12.8％(126/981),D场9.1％(65/713),E场6.7％(72/1070)。采取D场4个年龄组的猪鼻拭子进行了支气管败血波氏杆菌和多杀巴氏杆菌的分离鉴定。这两种细菌的感染率在繁殖母猪均为6.7％(1/15),这些采样母猪的哺乳仔猪各为33.3％(10/30)和40.0％(12/30),断乳小猪各为93.3％(28/30)和46.7％(14/30),有典型症状的育成猪各为40.0％(12/30)和36.7％(11/30)。在分得的47株多杀巴氏杆菌中,11个A型株有2株产生皮肤坏死毒素,36个D型株全都产生这种毒素。另外,有些多杀巴氏杆菌分离株的糖发酵能力与文献记载稍有不同。流行病学和细菌分离鉴定的结果表明,该大型养猪场发生的持续性萎缩性鼻炎是由支气管败血波氏杆菌和产毒素多杀巴氏杆菌菌株混合感染引起的。     

竹鼠源绿色气球菌和大肠杆菌的分离鉴定及致病分析

从贵州省某竹鼠养殖场送检的6只患病竹鼠的不同组织病料中分别分离到两种不同的细菌,经细菌形态观察、生化试验鉴定、16S rDNA基因序列分析,确定两株分离菌一株为大肠杆菌,命名为GZ-QDN1;另一菌株为绿色气球菌,命名为GZ-QDN2。药敏试验结果显示,分离菌株GZ-QDN1对头孢曲松、头孢拉啶、复方新诺明等9种药物有较强的敏感性,分离菌株GZ-QDN2对恩诺沙星、多黏菌素B、新霉素等10种药物有较强的敏感性。动物回归试验结果显示,分离菌GZ-QDN1和GZ-QDN2具有较强的致病性,对竹鼠的半数致死量LD50分别为1.45×106CFU/m L和1.75×106CFU/m L。组织病理学观察显示,死亡竹鼠心脏、肾和肺等发生了细胞排列较疏松、出血、粒细胞浸润等病理变化。本研究从竹鼠体内分离到致病性大肠杆菌和绿色气球菌各1株,为该竹鼠养殖场查明了主要病因并为细菌性疫病的防治提供了用药参考。     

猪源肠道益生乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性的研究

从健康仔猪体内分离到1株乳酸菌,利用微生物系统分析仪以及16S r RNA基因测序比对,确定该分离株为屎肠球菌(E.faecium),遂将其命名为LY001。并进一步对其抗逆性、耐药性、生物被膜形成、抑菌性能以及对小鼠的致病性等生物学特性进行研究。结果,该菌株在大约6 h以后生长达到稳定期,具有较好的抗逆性;它对青霉素类、头孢菌素类以及喹诺酮类表现敏感,对氨基糖苷类、大环内酯类以及四环素类表现耐药;它具有一定的生物被膜形成能力;其培养上清能在一定程度上抑制大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌的生长;该菌对小鼠不具有致病性。以上结果表明,该分离株有潜力作为优良益生菌制剂的菌株。     

一株致猪胃溃疡大肠杆菌的分离鉴定

四川某猪场暴发保育猪与育肥猪水样腹泻,病理剖解可见胃黏膜大面积脱落、胃溃疡等症状,采集病死猪扁桃体与肠系膜淋巴结进行病毒检测;以肠内容物做寄生虫卵检测;选取其中一代表病例做细菌分离,经小鼠致死试验、仔猪回归试验确定病原菌,并对病原菌进行了形态学观察、生化鉴定、16SrDNA序列分析及药敏试验。结果显示,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等的检测结果为阴性;无寄生虫感染;从十二指肠内容物中分离到1株疑似致病性大肠杆菌,并命名为SCDC-1。用SCDC-1株人工感染健康仔猪成功复制出水样腹泻、胃溃疡病例。对SCDC-1株进行16SrDNA克隆测序,并与GenBank中的8株肠杆菌科和4株巴氏杆菌科菌株的16S基因进行同源性分析,发现SCDC-1株与大肠杆菌16S基因的相似性高达99.5%～99.9%。药敏试验结果显示,该病原菌仅对头孢曲松钠、头孢吡肟、丁胺卡那霉素敏感。试验结果证实,引起此次保育猪与育肥猪胃溃疡的主要病原为致病性大肠杆菌。     

115株鸭疫里氏杆菌的PFGE分型

本研究旨在通过建立鸭疫里氏杆菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)指纹图谱数据库,探讨不同来源的鸭疫里氏杆菌的流行病学及传播特征。2013年2月到2015年7月,从广东省9个城市收集具有典型鸭疫里氏杆菌病症状的病(死)鸭和鹅的脑、肝组织样品,分离培养鸭疫里氏杆菌。采用全自动微生物鉴定仪鉴定疑似菌株,并进一步用特异性PCR进行鉴定。对分离得到的菌株进行SmaⅠ-PFGE分子分型。结果显示,共分离得到115株鸭疫里氏杆菌,其中鸭源54株,鹅源61株。其中,58株菌株分型成功,得到16种不同的SmaⅠ-PFGE型(以相似度≥90%为判定标准),包括11个簇(Cluster)和5个单一型(Single type)。上述研究结果表明,分离得到的鸭疫里氏杆菌存在广泛的克隆传播,且存在于不同种属的宿主动物(鸭和鹅)之中。     

肉鸡白色念珠菌的分离鉴定与基因分型

从病鸡嗉囊分离出3株酵母状真菌;在不同培养条件下观察分离菌株的菌落与个体形态特征;用分离菌株BCA1在雏鸡上进行人工感染试验;对原分离菌株和再分离菌株BCA1-1用rDNA-ITS序列分析鉴定,并以其25SrDNAⅠ型内含子序列进行基因分型。结果显示,3个分离菌株均为白色念珠菌,归属于2个基因型,BCA2株属于A型,BCA1和BCA3株的扩增产物包括C型的2条带和介于其间的第3条带。在人工感染试验中,雏鸡发病率为88%,病死率为68%,症状与临床自然发病的相一致;再分离菌株BCA1-1与接种菌株BCA1相同。可见,导致该批肉鸡发病的病原确系白色念珠菌,3个分离株中的2株不同于已知的基因型。     

断奶仔猪胃肠道乳酸菌及芽孢杆菌的分离鉴定

为研制优良的猪用益生菌制剂,从断奶仔猪胃肠道分离乳酸菌和芽孢杆菌,结合细菌的形态特征、生理生化指标,运用16SrRNA基因序列分析方法对其进行了鉴定。结果表明,分离株WR、KR、HR、JR分别为胃、空肠、回肠、结肠源的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius);ZR株为直肠源的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii);MR株为盲肠源的粪肠球菌(Enterococcus faecalis);分离株WY、SY、KY分别为胃、十二指肠、空肠源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);HY株为回肠源的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cere-us)。各分离株的生长曲线有明显差异,HR、ZR和WY株的生长速度较快,分别于接种后第12、12和20小时达到生长高峰期,显示了良好的培养特性。     

屎肠球菌携带毒力基因及其耐药性检测

为探究屎肠球菌携带毒力基因及耐药性相关基因,本研究采用PCR方法对不同来源的41株屎肠球菌中携带10种毒力基因、万古霉素耐药基因和四环素耐药基因进行检测,并应用K-B纸片法分析屎肠球菌对9种抗生素的敏感性。结果表明,在41株屎肠球菌中检测3种毒力基因gel E、efaAfs和ccf的阳性率均为100%,其他毒力基因的阳性率依次为cpd(80.49%)、agg(39.02%)、cylM(4.88%)、cylB(9.76%)、cylA(9.76%)、cob(4.88%)及esp(0);在41株屎肠球菌中,能检测出4种毒力基因的菌株数占46.34%,能检测到5种毒力基因的菌株数占29.27%;41株屎肠球菌对庆大霉素、萘啶酸和卡那霉素的耐药率均为100%,对其他抗生素的耐药率分别为诺氟沙星(31.7%)、四环素(26.83%)、氯霉素(7.31%)、万古霉素和阿莫西林(4.88%)、氨苄西林(0)。通过对不同基质屎肠球菌携带毒力基因和耐药性的检测分析,为今后屎肠球菌毒力基因和耐药性的分子机制研究奠定基础。     

晋中地区鸡致病性大肠杆菌分离株的鉴定及其16S rDNA序列的同源性分析

为了鉴定晋中地区鸡致病性大肠杆菌,利用传统细菌鉴定方法及16S rDNA序列分析,对分离自晋中地区养殖场送检的30只病死鸡肝中的疑似大肠杆菌菌株进行鉴定及遗传进化分析。结果表明:分离出8株致病性不同的大肠杆菌;鉴定出O78、O2、O11共3种血清型;8株菌均为多药耐药菌,其中对5种及5种以上抗菌药物耐药的菌株达到总分离菌株的87.5%;将8株菌株的16S rDNA基因序列与GenBank中登录的大肠杆菌参考株的16S rDNA基因序列进行比对,同源率均达到99%。经MEGA6.0软件分析后,其位于不同的分支上。本研究结果为进一步研究致病性大肠杆菌的耐药性和对晋中地区大肠杆菌病的有效防治奠定了一定基础。     

鸡源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为筛选出对禽沙门菌具有显著拮抗效应的益生菌,从健康肉鸡消化道分离菌株,经细菌形态观察、生化试验鉴定及16S rDNA基因序列分析,共鉴定出14株唾液乳杆菌。体外琼脂扩散试验结果显示,WLS001、WLS002、WLS003、WLS004这4株分离株分别对鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有明显抑制作用。pH及胆盐耐受性试验结果表明,WLS001耐受性最强,在pH为2.0、胆盐浓度0.2%条件下均能生存。药敏结果显示,4株菌均对万古霉素耐药。安全性试验表明,所有唾液乳杆菌均没有溶血环,试验组雏鸡体重较对照组增重显著(P0.05)。组织病理切片显示,脾、肝、盲肠及十二指肠形态均正常。结果表明,4株鸡源唾液乳杆菌具有良好的生物学特性和安全性,具备进一步开发微生态制剂的潜力。     

大熊猫源肠球菌分布特点的研究

采用全自动微生物分析系统VITEK 2-COMPACT,结合16SrDNA分子鉴定以及菌落形态特征分别对野生、野化和圈养环境下大熊猫源肠球菌进行鉴定,共计分离鉴定得到11种肠球菌,共计381株。野生大熊猫样品中分离得到10种肠球菌,共103株,占27.03%;圈养大熊猫样品中分离得到8种肠球菌,共149株,占39.11%;野化放归前大熊猫样品分离得到6种肠球菌,放归后增加到9种,共129株,占33.86%。粪肠球菌、小肠肠球菌、坚韧肠球菌和屎肠球菌是野化和圈养大熊猫肠球菌的优势菌,粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、鸟肠球菌和棉子糖肠球菌为野生大熊猫肠球菌的优势菌。野化大熊猫源肠球菌的种类介于野生大熊猫和圈养大熊猫之间,野化放归后,大熊猫粪便中肠球菌的种类增加,各类肠球菌所占比例更均衡,有利于放归大熊猫快速适应野外生存环境。