青海高原产纤维素酶康氏木霉的酶促动力学研究

对分离自青海省东部土壤的产纤维素酶康氏木霉 (Trichodermakoningii) 0 14 3p株进行产酶条件优化及酶促动力学特性研究。结果表明 ,T .koningii 0 14 3p菌株在麦麸为碳源、尿素为氮源、起始 pH值为 7.0、2 8℃培养 6d的条件下产酶量最高。在此产酶优化条件下 ,0 14 3p菌株的湿固体发酵物滤纸酶活力 (FPA)可达 32 μmol/min ,为原产酶条件的 1.6倍 ;酶作用的最适温度为 5 0～ 5 5℃ ,最适 pH 4 .8。T .koningii 0 14 3p菌株可作为纤维素酶解饲料的酶源菌 ,具有良好的饲用前景     

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

对分离的20株鸡源致病性大肠埃希氏菌进行药敏试验,筛选出13株耐氧氟沙星(OFL)的菌株,进行质粒提取、电泳和转化试验,获得1株由质粒介导的耐OFL多重耐药菌株.该菌株对参试的11种抗生素全部耐药,其中OFLMIC高于50μg/mL.该菌R质粒电泳可见6条带,转化大肠埃希氏菌DH5α在含20 μg/mL OFL的LB平板筛选得到转化子.该转化子含有原菌株中2.7×103b的质粒,获得原菌株部分耐药性.连续转化5次,均获得耐OFL的转化子,证实该菌株对OFL的耐药性由质粒介导.     

体外耐氟喹诺酮类鸡毒霉形体gyrA基因的突变特征分析

按常规方法提取了鸡毒霉形体参考株S6 10 、疫苗株F14 8及在氟喹诺酮类药物压力下筛选出来的耐药株的基因组DNA ,扩增了各菌株DNA旋转酶 gyrA基因片段 ,并进行了克隆、测序 ,利用DNAsis软件对测序结果进行分析。结果表明 ,S6 10 和F14 8在恩诺沙星或环丙沙星压力下均筛选出不同程度的耐药菌 ,而且恩诺沙星致鸡毒霉形体发生耐药性突变的几率高于环丙沙星 ,S6 10株耐药突变频率高于F14 8;S6 10 筛选出来的耐药菌株发生突变的位置在DNA旋转酶GyrA亚基的第 83位 (相对于大肠埃希氏菌GyrA亚基中的位置 ,以下同 )和第 87位上 ,取代模式分别为Ser→Ile、Glu→Gln ,另外 1株高水平耐药株 (Se10 ,MIC≥ 12 8)在第 10 3位也发生了氨基酸取代 (Ile→Val) ;F14 8筛选出来的耐药菌株只在DNA旋转酶GyrA亚基的第 87位发生了突变 (Glu→Gly/Gln)。     

抗鸡致病性大肠埃希氏菌O_(88)单克隆抗体的研究

用纯化的鸡致病性大肠埃希氏菌O88 菌株( MG38e) 热灭活抗原免疫BALB/c 雌性小鼠,再用该菌株粗提的脂多糖尾静脉注射加强免疫后,取其脾细胞与SP2/0 细胞融合,经有限稀释法克隆,用间接ELISA 及凝集试验(IHT) 筛选,获得4 株能稳定分泌该菌株单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养液ELISA 和IHT 效价分别为1∶100 ～1∶1000 和3 log2 ～4 log2 ;腹水效价分别为1∶100 ～1∶4000 和4 log2 ～10 log2 。这4 种单克隆抗体( E1 、E2 、E3 、E4) 均能与鉴定的7 株O88菌株发生凝集反应,E4 株还能与O78菌株发生凝集反应。用单克隆抗体对分离的45 株鸡致病性大肠埃希氏菌进行血清型鉴定,结果5 株为O88 ,与用单因子血清鉴定的结果一致。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌 2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为 14 96bp目的片段的引物 ,建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌 2型参考株SS2 N株的检测结果为阳性 ,对马链球菌兽疫亚种 (C群 )参考株ATCC3 5 2 46、分离株SESZ Y、SESZ T、SESZ C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏菌的检测结果均为阴性 ;用EcoRⅠ内切酶进行酶切 ,获得了与预期结果一致的 863bp和 63 3bp的 2个片段。经对SS2 1株的PCR产物进行测序及序列分析 ,表明其与 193 3株、P1/ 7株的核苷酸同源性分别为 99.7%和 10 0 %。     

空肠弯曲菌质粒与其生物学特性的关系

对不同来源的空肠弯曲菌的质粒及其与菌株来源、生物型、致病性和耐药性的关系进行了研究。共检出大小分别为 1.9、2 .3、2 .6、5 .6、12 .6、33.0、82 .0和 10 8.0kb的 8种CCC型质粒 ,构成 7种质粒谱型。健康鸡源菌的质粒阳性率为 0 ;患病鸡源菌为 1.96 % ;患病猪源菌为 4 5 .8% ;健康羔羊源菌为 0 ;患病人源菌为 0。空肠弯曲菌的质粒用EcoRⅠ酶切后 ,1.9和 2 .3kb质粒的酶切谱随菌株来源的不同而异 ,其他 6种质粒的酶切谱没有差异。统计分析表明 ,空肠弯曲菌质粒的质粒谱型和酶切谱型与菌株来源、Lior生物型、致病性相关 (P <0 .0 0 1) ;也与对链霉素 (P <0 .0 0 1)、萘啶酸 (P <0 .0 5 )的耐药性相关 ;空肠弯曲菌对链霉素的耐药性与 2 .3kb的质粒有关 (P<0 .0 5 )。     

食品动物源沙门菌fosA_3基因的流行及传播特征

为研究质粒介导的磷霉素耐药基因fosA_3在食品动物源沙门菌中的流行状况及传播特征,采用PCR方法对本实验室保存的288株动物源沙门菌进行磷霉素耐药基因fosA_3、fosA和fosC2的检测,用琼脂稀释法测定阳性菌株对17种抗生素的敏感性,PCR检测其他相关耐药基因,玻片凝集法确定其血清型。采用脉冲场凝胶电泳(PFG E)和多位点序列分型(M LST)分析菌株间的亲缘关系。采用接合转移/转化、复制子分型、S1-PFGE和Southern杂交等对fosA_3的水平传播和质粒特征进行分析。结果显示,共筛选得到6株(2.1%)fosA_3阳性沙门菌,没有检测到fosA和fosC2。6株fosA_3阳性菌均表现出多重耐药,且同时携带blaCTX-M-9G(均为blaCTX-M-14)基因和floR基因,血清型检测均为印第安纳型。6株菌均为MLST(ST)17型,PFGE结果显示其图谱相似。质粒分析结果显示,fosA_3能通过IncN或IncA/C型质粒与blaCTX-M基因发生共同转移。本研究首次从国内不同地区采集的鸡粪便拭子样本中分离得到的沙门菌中检测到fosA_3基因,菌株的克隆传播和fosA_3与blaCTX-M随质粒的水平传播都加速了耐药性的散播,对公共卫生构成潜在威胁。     

疣状毛癣菌免疫原性的研究

本研究以疣状毛癣菌LTV菌株制成活菌湿苗、活菌冻干苗、灭活冻干苗及其代谢产物冻干菌,给犊牛进行肌肉注射免疫接种。活菌湿苗免疫4头牛,结果4/4保护,而湿苗对照组2/17保护;活菌冻干苗免疫7头牛,结果5/7保护;灭活冻干苗免疫7头牛,6/7保护;代谢产物冻干苗免疫5头,0/5保护;冻干苗对照组0/7保护。其结果证明,疣状毛癣茵(Trichophytonverrucosum)菌体对牛具有良好的免疫原性。     

牛支原体二氢硫辛酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物酶比活性的测定

参照GenBank中牛支原体PG45株二氢硫辛酸脱氢酶基因(pdhD)的序列设计特异性引物,应用PCR扩增牛支原体武威株的pdhD基因,然后将其克隆至pMD19-T。在完成测序及点突变的基础上构建重组表达质粒pET-28a(+)-pdhD,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化表达产物His-DLD,并对其酶促反应活性进行测定。结果显示,表达产物在底物NADH存在条件下,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,且其最适酶促反应温度为25℃、pH为7.5;其米氏常数Km(NADH)为9.72μmol/L,最大反应速率为25.6μmol/(L·min)。上述结果为研究二氢硫辛酸脱氢酶的生物学功能奠定了基础。     

利用aroA基因建立鸡传染性鼻炎PCR诊断方法

利用aroA基因设计了1对引物,分别对10株标准副鸡嗜血杆菌(HPG)菌株、14株分离的HPG菌株进行PCR扩增,结果均得到了与预期大小一致的片段,而对10株非HPG菌株和3株病毒进行扩增则无相应片段产生;该PCR能检测出10个菌细胞.与常规PCR方法相比,aroA-PCR的敏感性更高.