长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析.以新合成的长角血蜱饥饿和半饱血雄蜱cDNA第一链为模板,用RT-PCR方法对从文库中挑选的5个表达序列标签(EST)进行鉴定.初步获得18个EST,BlastX分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白.RT-PCR鉴定结果显示,随机挑选的5个新EST中有3个在半饱血状态下差异表达.结果表明,成功地构建了长角血蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库,获得了有潜在生物学功能的EST.     

小亚璃眼蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的边缘革蜱4D8基因序列设计1对引物,采用PCR技术自半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺cDNA表达文库中扩增获得了4D8基因;将其连入pMD18-T载体,构建重组克隆载体pMD18-Hyaa4D8.测序分析表明,克隆的小亚璃眼蜱4D8基因与边缘革蜱4D8基因的核苷酸序列的同源性为89.2%.将此片段定向亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Hyaa4D8,表达并纯化重组蛋白,通过免疫印迹试验鉴定该重组蛋白的生物学活性.结果显示,该重组蛋白是分子质量为45ku的融合蛋白,且表达产物能被半饱血小亚璃眼蜱雌性成蜱唾液腺抗原免疫兔血清识别.     

微小牛蜱Bm91基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bin91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物.采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoR I酶切位点,构建重组表达载体pPIC9K-Bm91.再次测序正确后将其用Sac Ⅰ内切酶线性化,电转化毕赤酵母GS115并经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达.表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,Bm91基因获得了成功表达,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的83 ku的重组Bm91蛋白.     

青海血蜱成蜱cDNA表达文库的免疫学筛选及阳性克隆分析

采用兔抗青海血蜱幼蜱阳性血清,对青海血蜱成蜱cDNA表达文库进行免疫学筛选,并对获得的阳性克隆进行序列测定及同源性分析.结果显示,共获得9个新cDNA序列,其中3个新基因序列已被GenBank接受,并获得序列接受号.表明,从青海血蜱成蜱cDNA表达文库筛选到一批新基因,为青海血蜱保护性抗原的筛选奠定了基础.     

几种蜱MLP基因的表达及其表达产物反应原性的分析

通过对饥饿的长角血蜱雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,以期获得长角血蜱MLP基因全长cDNA序列。设计通用引物,采用PCR方法分别从青海血蜱、麻点璃眼蜱、森林革蜱、微小牛蜱及小亚璃眼蜱中对MLP基因完整的开放阅读框进行了扩增,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。结果表明,成功扩增了长角血蜱的MLP基因全长序列及多个蜱种的MLP基因开放阅读框序列,体外高效诱导表达了约39.2ku的不同蜱的MLP重组蛋白。Western-blot结果表明,长角血蜱的MLP重组蛋白具有很强的反应原性,且不同蜱的重组蛋白间具有很强的交叉反应性。     

不同抗体对青海血蜱唾液腺蛋白组分的识别差异

通过利用青海血蜱唾液腺蛋白皮下注射绵羊和将蜱在绵羊体直接饲喂2种免疫途径制备了2种阳性血清。利用这2种阳性血清分别与青海血蜱唾液腺天然蛋白进行免疫学反应,结果显示青海血蜱唾液腺中分子质量为22 ku和37 ku的2种天然蛋白能被利用蜱唾液腺蛋白皮下注射绵羊产生的阳性血清所识别,而不能被蜱叮咬的绵羊的阳性血清所识别。结果表明,在蜱正常叮咬宿主动物时,其唾液腺内的某些组分不与宿主的免疫系统相互作用,但这些组分具有免疫原性。     

微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。     

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

微小牛蜱Bm86基因的克隆及真核表达载体的构建

为了克隆微小牛蜱Bm86 基因及构建该基因的表达载体,以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板,参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列,设计了1对引物,采用RT-PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因;将Bm86基因克隆入载体,并进行序列分析,结果证明,克隆的Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因序列的同源性达97.4%,而且该序列包含完整的开放阅读框。将该基因克隆入真核表达载体 pPIC9K,构建并获得了重组真核表达载体pPIC9K-Bm86。     

残缘璃眼蜱subolesin基因的原核表达及表达产物的反应原性分析

为研究残缘璃眼蜱subolesin基因的生物学特性以及寻找新的抗蜱和蜱传病疫苗候选抗原,根据GenBank上登录的小亚璃眼蜱subolesin基因核苷酸序列设计特异性引物,以残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱的饥饿成蜱cDNA为模板,扩增出subolesin基因的完整阅读框(ORF)。将残缘璃眼蜱subolesin基因的PCR产物经EcoRⅠ+NotⅠ双酶切后连接至表达载体pGEX-4T-1,把重组质粒pGEX-4T-1-subolesin导入感受态细胞BL21(DE3)中,在37℃、1mmol/L IPTG条件下诱导表达。利用SDS-PAGE分析subolesin基因的体外表达特征;用Western-blot分析Subolesin蛋白的反应原性。结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱subolesin基因的ORF长度分别为492、492、486bp,分别编码163、163、161个氨基酸。subolesin基因序列和推导的氨基酸序列的比对结果显示,残缘璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、微小牛蜱与参考的小亚璃眼蜱的核苷酸序列同源性分别为98%、98%、89%,氨基酸序列同源性分别为98%、99%、93%。SDS-PAGE和Western-blot结果显示,重组残缘璃眼蜱Subolesin蛋白的分子质量为45ku,纯化的subolesin重组抗原可与抗残缘璃眼蜱全蜱血清、残缘璃眼蜱唾液腺、卵巢血清有较强的反应原性。     

山羊痘弱毒疫苗株TK基因的克隆及序列分析

以提取的山羊痘弱毒疫苗株HLJ-V9 DNA为模板,设计特异性引物并进行PCR扩增,获得了2078 bp的DNA片段,并将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明,成功获得了TK基因,获得的TK基因内存在一个KpnⅠ酶切位点和编码区的早期转录终止信号TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明,弱毒疫苗毒株HLJ-V9 TK基因与参考毒株的同源性在95.5%~100%之间,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。     

抗脂肪细胞特异膜蛋白单链抗体基因的克隆及序列分析

从分泌抗 4 0ku脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA ,经RT PCR扩增抗体轻、重链可变区基因 ,然后与Linker连接组装成单链抗体基因 (scFv)。结果 ,成功地构建了scFv基因 ,其排列方式为VH linker VL。经序列分析表明 ,scFv基因全长 74 1bp ,VH基因全长 36 9bp ,VL基因全长 32 7bp。抗脂肪细胞膜蛋白单链抗体基因的构建为进行该抗体基因的表达奠定了基础     

利用PCR检测鸭瘟病毒

参照文献 ,设计和合成了 1对引物。用这对引物 ,以标准毒株DPVF3 4的DNA为模板 ,经PCR扩增出 1个特异的DNA片段。经序列测定 ,该DNA片段由 42 0bp组成。与文献报道的序列比较 ,该片段为鸭瘟病毒UL6基因DNA的一部分 ,与美国毒株LakeAndes(LA)的同源性达 99%。用该PCR方法扩增小鹅瘟病毒、细小病毒和禽巴氏杆菌 ,结果为阴性。以该PCR方法检测 6份送检病料 ,5份为阳性 ,检出率与病毒的分离一致。另外 ,该方法检测DPVDNA的敏感性达到了 1pg水平     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因的克隆与序列分析

对鸡毒霉形体内蒙古分离株H3 株的TM 1基因进行了克隆和序列分析。根据巳发表的MGS6株TM 1蛋白基因序列分析设计了 1对引物 ,以H3 株DNA为模板进行PCR扩增 ,得到约 0 .8kb的片段 ,将该产物克隆到pUCm T载体上 ,得到重组质粒。经Kieser法、质粒PCR法、PstⅠ单酶切等方法鉴定后 ,测定H3 株TM 1基因序列 ,并与已知S6株TM 1基因序列进行了比较 ,结果表明 ,MGH3 株与S6株TM 1基因核苷酸序列同一性为 96.5 7% ,氨基酸同一性为95 .42 %。这些结果为进一步研究MGH3 株的基因免疫和基因工程疫苗等奠定了基础     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

广东鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的分子生物学特征

为了解广东地区鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的分子生物学特征,选择从该地区分离到的4株鸽源禽Ⅰ型副黏病毒(SD-55株、JM-11株、SZ-14株、ZQ-17株)进行了F基因的扩增及序列测定。结果表明,这4株病毒的F蛋白裂解位点均符合禽Ⅰ型副黏病毒强毒株裂解位点氨基酸序列的分子特征,与中国大陆鸽源APMV-1分离株Pigeon/YN-P1相比,相似率在95%以上。将其与GenBank中的18株鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的相应序列进行比较分析,并绘制系统进化树,发现分离株SD-55株、JM-11株、SZ-14株位于以意大利分离株Pigeon/Italy/1166/00为代表的欧洲进化分支,而ZQ-17株位于以美国分离株Pigeon/U.S.(TX)/98为代表的美洲进化分支,经鉴定以上4株病毒均为基因Ⅵb1型禽Ⅰ型副黏病毒。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因,结果。均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到 pMD18-T载体上,获得重组质粒,经PCR和EcoR Ⅰ Sal Ⅰ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明,广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白,分子质量约为16．8 ku,与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％,氨基酸序列同源性分剐为23．6％～24．8％和97．6％～99．4％。     

新兴猪IL-18成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登录的猪白细胞介素18(pIL 18)基因序列,设计了1对特异引物。利用RT PCR对从3周龄新兴仔猪脾细胞中提取的总RNA进行了扩增,获得了约500bp的片段。将该片段克隆、鉴定、测序,证实已获得了新兴猪IL 18成熟蛋白基因片段,其大小为474bp,编码157个氨基酸,与GenBank上登录的猪IL 18成熟蛋白基因序列完全一致。     

D28k钙结合蛋白cDNA的克隆及序列分析

利用RT PCR技术从鸡小肠组织RNA中扩增鸡D2 8k钙结合蛋白cDNA ,以进一步研究D2 8k钙结合蛋白促进肠钙吸收的机理。结果表明 ,鸡肠道D2 8k钙结合蛋白cDNA的开放阅读框由 789个碱基对组成 ,编码由 2 6 2个氨基酸组成的多肽 ,分子质量约为 2 7.9ku ;禽类D2 8k钙结合蛋白基因长 18.5kb ,10个间插序列将其分成 11个编码外显子 ,启动子区以GC为主 (6 0 %～80 % )。D2 8k钙结合蛋白氨基酸序列的同源性在鼠和人之间达到 98.5 % ,在蟾蜍和鸡之间达到80 .9% ,在人和鸡之间为 79.8% ,在鼠和鸡之间为 79.5 %。不同种属的动物之间D2 8k钙结合蛋白的氨基酸序列存在较高的同源性。