转染βG基因HHCC细胞裸鼠转移模型的转移特性改变机理研究

采用脾种植法复制裸鼠肝癌模型,待60 d转移灶形成后分别取肝、肾、肠系膜淋巴结等,以常规方法制成组织切片,ABC免疫组化染色,同时用人肝癌细胞株(HHCC)作对照.结果,试验组30例标本中β-葡萄糖苷酸酶(βG)表达阳性率达100%,PCNA指数阳性率为96.7%,nm 23表达阳性率高达13.3%;而对照组30例标本中βG表达阳性率为3.3%;PCNA指数阳性率为33.6%;nm 23表达阳性率高达100%.试验数据经统计学处理,具有显著性差异(P＜0.01).表明βG改变PCNA、nm 23等肿瘤相关因素在体内的表达是肝癌细胞转移能力增强的原因之一.     

玉米赤霉烯酮对小鼠免疫器官的毒性作用

采用腹腔注射给药方式研究了玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEA)对小鼠免疫器官的毒性作用。结果表明,连续6d注射25mg/kgZEA后,试验小鼠的胸腺指数与对照组相比显著降低(P0.05),胸腺明显萎缩,胸腺细胞出现典型的凋亡峰,脾指数降低但与对照组差异不显著(P0.05),脾淋巴细胞未见典型的凋亡峰;单次注射50mg/kgZEA48h后,胸腺细胞和脾淋巴细胞均发生细胞周期阻滞,均显著阻滞于细胞周期的G2/M期;连续3d注射50mg/kgZEA后,小鼠胸腺和脾出现病理性变化,表现为胸腺皮质减少,髓质增多,脾白髓萎缩,局灶性坏死等。证明ZEA对小鼠胸腺和脾有明显的毒害作用。     

小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中。对经鉴定的重组质粒pMD-Ghrelin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达。采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平。结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P0.05或0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P0.05)。qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc(P0.05)、E2F1、CDK2(P0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P0.05)。以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡。     

黄芪颗粒对DON致BALB/c小鼠免疫损伤的保护作用

为探讨黄芪颗粒对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)致BALB/c小鼠免疫抑制的保护作用,将48只BALB/c小鼠随机均分为空白对照组、黄芪对照组、DON组和黄芪-DON组。黄芪对照组和黄芪-DON组提前1周在饮水中添加黄芪颗粒(0.02 g/mL),连续5周;DON组和黄芪-DON组灌喂DON 2.4 mg/(kg·d),连续28d。每天观察体质量、采食量、脏器系数、病理组织学、血液学指标等的变化;采用ELISA试剂盒测定血清IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α、TGF-β水平变化,用实时荧光定量PCR检测上述细胞因子基因mRNA的表达,并采用流式细胞术检测脾CD4~+、CD8~+、CD3~+、CD19~+T细胞。结果显示,黄芪-DON组的体增重、采食量和脾系数显著高于DON组(P0.05),肝系数、肾系数显著减小(P0.05);通过病理组织切片观察,发现黄芪-DON组肝、肾的病变程度明显低于DON组;黄芪-DON组CD4+/CD8~+、CD19~+和血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、TGF-β水平均显著高于DON组(P0.05),脾中IL-2、IFN-γ、TGF-β基因mRNA的表达量也显著高于DON组(P0.05)。结果表明,黄芪颗粒能明显减轻DON所致肝、肾损伤,缓减DON诱导的免疫抑制,可显著提升机体的免疫水平。     

幼建鲤维生素C缺乏的病理组织学观察

将192尾体重为11.18 g±0.57 g(P＞0.05)的健康幼建鲤随机分为2组,分别喂以含维生素C60 mg/kg的半纯合饵料和维生素C缺乏(0 mg/kg)饵料133 d,观察幼建鲤器官组织的病理学变化.试验结果显示,维生素C缺乏组幼建鲤出现肝细胞变性、坏死,肾小管上皮细胞变性、坏死、脱落,脾网状基质细胞肿胀,心肌纤维肿胀、变性,肌纤维变性、坏死等病理变化;电镜观察显示,胰腺腺细胞中的酶质颗粒溶解呈空泡状,肌纤维细胞断裂,肠上皮细胞绒毛断裂,脾网状基质肿胀.表明幼建鲤维生素C缺乏可导致组织器官出现不同程度的病理损伤.     

柔嫩艾美球虫感染对鸡体内一氧化氮水平的影响

对33日龄健康罗曼公鸡口服接种1.5×105个柔嫩艾美球虫孢子化卵囊,分别于感染0、2、4、6和8 d扑杀,检测其血清、心、肝、脾、肺和肾组织NO含量.结果表明,试验鸡血清NO水平在感染第4 d显著低于对照鸡(P＜0.05),至感染第8 d显著高于对照鸡(P＜0.05);心、肺NO水平与对照鸡相比差异不显著(P＞0.05);肝NO水平在感染第6 d极显著高于对照鸡(P＜0.01),其他时间与对照鸡无显著差异(P＞0.05);脾NO)水平在感染第2 d和第8 d均显著低于对照鸡(P＜0.05);肾NO水平在感染第2 d极显著高于对照鸡(P＜0.01),自第4 d到试验结束与对照鸡相比差异不显著.提示在鸡柔嫩艾美球虫感染过程中NO)可能通过介导机体免疫而参与抗病作用.     

小反刍兽疫病毒H基因过表达对病毒增殖的影响

为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。     

超声作用对绵羊胎儿成纤维细胞转染效率的影响

为研究超声波对经脂质体介导的绵羊胎儿成纤维(sheep fetal fibroblasts,SFF)细胞转染效率的影响,用不同频率的超声波在不同时间内辐射经脂质体介导的SFF细胞,转染48h后收集细胞,用RT-PCR检测目的基因,台盼蓝染色检测细胞活性。转染后用G418挑选转基因单克隆细胞,计算转染率。结果显示,对细胞、质粒和脂质体的混合液共同超声辐射(时间60s,超声频率为2.5MHz)后转染,转染率要明显高于未超声辐射的细胞和先转染后超声辐射的细胞,并且细胞的存活率较高。结果表明,超声辐射不仅能改变细胞质膜的通透性,还能够提高脂质体介导的基因转染效率,增强基因介导的特异性和靶向性。     

禽呼肠孤病毒σA基因对鸡胚成纤维细胞天然免疫相关基因转录水平的调控影响

为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P0.05或P0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P0.05或P0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。     

JA1对体外培养的Hep细胞和小鼠皮下移植性Hep细胞凋亡的影响

采用噻唑蓝(MTT)还原法、流式细胞术、光镜及透射电子显微镜技术等检测了梯度浓度的JA1(沙冬青提取物)对体外培养的小鼠肝癌细胞株Hep增殖的影响及诱导Hep细胞凋亡的作用;并检测了JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞的生长抑制及诱导凋亡作用.结果显示,JA1可显著抑制小鼠Hep细胞的增殖,且这种抑制有浓度和时间依赖性.流式细胞仪分析显示,JA1处理后的Hep检测样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生了改变,细胞在G1期被阻滞.同时,JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞也有明显的抑制作用.JA1灌胃试验组瘤组织细胞DNA直方图有明显的凋亡峰,细胞在G1期也被阻滞,光镜和电镜下可见大量凋亡肿瘤细胞.     

REV感染对SPF雏鸡胸腺细胞增殖和细胞周期及周期素D1的影响

为了探索禽网状内皮组织增生病病毒(REV)感染SPF雏鸡后,对其胸腺细胞增殖、细胞周期分布以及Cyclin D1的影响,将66只1日龄SPF雏鸡随机分为REV感染组和对照组,使用Cell counting Kit-8、流式细胞术、Western-blot、荧光定量PCR等方法对雏鸡胸腺细胞增殖、细胞周期及Cyclin D1 mRNA和蛋白的动态变化进行检测。结果发现,REV感染SPF雏鸡后,其胸腺细胞的增殖能力于第14、21、28天明显低于对照雏鸡;G0/G1期细胞数于第14天较对照雏鸡明显(P0.05)升高,S、G2/M期细胞数量减少,第28天时相反;Cyclin D1 mRNA表达于第14天极显著(P0.01)低于对照雏鸡,第35天时极显著高于(P0.01)对照雏鸡;Cyclin D1蛋白量显著(P0.05)或极显著(P0.01)低于对照雏鸡。结果表明,感染REV后,雏鸡免疫机能下降可能与胸腺细胞增殖能力下降、细胞周期素D1 mRNA转录及蛋白质水平的异常表达相关。     

SPF雏鸡感染网状内皮组织增殖病病毒后白细胞介素2和干扰素诱生活性的变化

对1日龄SPF雏鸡人工感染网状内皮组织增殖病病毒(REV)后,胸腺T淋巴细胞白细胞介素2(IL-2)诱生活性于14～49 d极显著低于对照组(P＜0.01);脾T淋巴细胞IL-2诱生活性于14 d明显低于对照组(P＜0.05),感染后21～49 d极显著降低(P＜0.01);脾淋巴细胞干扰素(IFN)的诱生活性于感染后7～49 d极显著降低(P＜0.01).提示SPF雏鸡受REV感染后机体免疫器官的分子免疫调节机能明显降低或发生障碍.     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的研究

采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠胚胎成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,经过G418培养基加压筛选,定期观测每孔阳性克隆出现的时间、数量及生长状态;比较不同胎龄或日龄、细胞接种密度、传代次数、脂质体剂量对脂质体介导的SV40T基因转染东方田鼠胚胎和皮肤两种成纤维细胞效率的影响。结果显示,两种细胞的阳性克隆约在15 d后出现,随着胎龄或鼠龄的增加,阳性细胞克隆在数量和增殖程度上有减少和减慢的趋势;以接种密度为1×104/孔的胚胎和皮肤成纤维细胞转染和筛选效果最好,细胞克隆增殖最快,数量最多;随着传代次数的增加,细胞克隆转染和筛选效果变差;在其他条件一致的情况下,以1 L/孔脂质体使用剂量,阳性克隆出现的时间早、克隆数量多、生长状态好。     

mmu-miR-146a-5p对小鼠巨噬细胞的免疫调节作用

为了探究mmu-miR-146a-5p(小鼠源miR-146a-5p)对小鼠巨噬细胞分泌细胞因子的影响,本研究利用mmu-miR-146a-5p模拟物和抑制物分别转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,通过qPCR定量分析巨噬细胞中细胞因子和LPS/TLR4信号传导途径中关键基因的表达情况,通过Griess试剂测定巨噬细胞培养上清中的亚硝酸盐浓度来评价NO的分泌情况。检测结果显示,与阴性对照组相比,在模拟物转染组,LPS/TLR4信号传导途径的几个关键基因相对表达量显著上调,如TLR4和CD14(P0.05),而促炎因子(IL-1α、IL-1β、IL-12β)的相对表达量显著下调(P0.05),而在转染后第24和36小时NO的含量出现上调。在抑制剂转染组中,TLR4、CD14的表达水平下降,促炎因子IL-1α、IL-12β和TNF-α的表达水平上调,i NOS基因表达和NO产生在第24和36小时显著下降(P0.05)。结果表明,mmu-miR-146a-5p对小鼠巨噬细胞分泌细胞因子具有免疫调节作用。     

桔梗皂苷D对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的研究

分析了桔梗皂苷D对小鼠脾淋巴细胞增殖、细胞因子IL-2和IL-4分泌、细胞膜表面标志和细胞周期的影响,进而探讨了桔梗皂苷D对小鼠脾淋巴细胞的免疫调节活性。小鼠脾淋巴细胞经桔梗皂苷D刺激后,M TT法检测桔梗皂苷D对脾淋巴细胞增殖的影响;ELISA法检测桔梗皂苷D对脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-2和IL-4的影响;流式细胞术检测桔梗皂苷D对脾淋巴细胞膜表面标志和细胞周期的影响。结果表明,桔梗皂苷D能够提高脾淋巴细胞刺激指数,诱导脾淋巴细胞IL-2和IL-4的分泌,提高脾淋巴细胞CD4+/CD8+的比值、促进脾淋巴细胞从G 0/G1期进入S期。证实在一定质量浓度范围内,桔梗皂苷D可促进小鼠脾淋巴细胞增殖、诱导细胞因子分泌、提高CD4+/CD8+亚群比值、促进细胞进入DN A合成期,具有良好的免疫调节活性。     

17β-雌二醇对小鼠胸腺上皮细胞增殖和凋亡的影响

为探讨17β-雌二醇对小鼠胸腺上皮细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制,将小鼠胸腺上皮细胞系(MTEC1)细胞经不同浓度的17β-雌二醇处理24 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测细胞周期的变化;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况;DAPI染色法检测细胞核形态的变化;高通量测序技术获得差异基因表达谱并运用KEGG通路分析预测差异基因的作用通路;String基因互作分析差异基因的相互作用;实时荧光定量PCR验证p53通路相关基因的表达情况。结果显示,17β-雌二醇显著抑制MTEC1细胞的增殖活力,并呈浓度依赖性;使细胞周期出现G2/M期阻滞;能诱导MTEC1细胞凋亡,细胞核呈现不规则形态、核碎片、染色质凝聚和凋亡小体等典型的凋亡特征;KEGG通路分析显示,与细胞增殖和凋亡密切相关的p53信号通路呈极显著性差异;String基因互作分析显示,p53信号通路的相关基因互相作用,形成紧密联系的网络;p53信号通路的下游周期基因Cyclin B1表达下调,凋亡相关基因Trp53、Gadd45a、Fas、p21、Apaf1和Bax的表达水平显著上调。结果提示,雌激素可能通过p53信号通路对MTEC1细胞的增殖抑制、周期阻滞和细胞凋亡产生影响。     

妊娠期绵羊子宫内膜Fit-1基因表达的RT-PCR检测

以β-actin基因作为内源性内标,采用RT-PCR方法检测了Flt-1基因mRNA在东北细毛羊、小尾寒羊妊娠期不同阶段子宫内膜中的表达量.结果显示,绵羊妊娠期在不同阶段的子宫内膜中Flt-1 mR-NA均强烈表达,且随着妊娠期的延长,Fit-1 mRNA的表达量有逐渐增强的趋势(P＜0.05);在相同的妊娠阶段小尾寒羊子宫内膜中的Flt-1 mRNA表达量显著地高于东北细毛羊的Flt-1 mRNA表达量(P＜0.05).     

p53基因RNA干扰载体的构建及其在ST细胞系中的稳定表达

利用质粒介导的RNA干扰技术,建立稳定沉默p53基因的ST细胞系。通过改造p EGFP-C1载体,构建了猪源U6启动子启动编码p53 sh RNA序列的载体,将其转染ST细胞,用G418筛选细胞,并分析获得细胞的生长特性。RT-PCR和Western-blot结果显示,质粒介导的sh RNA有效地沉默了p53基因的表达;流式细胞术和细胞生长特性分析结果显示,与对照组细胞相比,p53基因沉默组ST细胞处于S期的细胞数量增多,而且p53基因沉默组ST细胞生长较快。本研究结果证实质粒介导的sh RNA高效、稳定地沉默了ST细胞中p53基因的表达。     

高铜对雏鸭脾影响的组织病理学观察

选用1日龄天府肉鸭360只,随机分为6组,分别以对照日粮(Cu 8 mg/kg)和高铜日粮(Ⅰ组:Cu100 mg/kg,Ⅱ组:Cu 200 mg/kg,Ⅲ组:Cu 400 mg/kg,Ⅳ组:Cu 600 mg/kg,Ⅴ组:Cu 800 mg/kg)饲喂6周,对高铜引起的雏鸭脾的病理损伤进行了观察.结果显示,Ⅰ、Ⅱ组雏鸭的脾组织学变化与对照组比较差别不明显,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾出现不同程度的淋巴细胞减少,电镜下,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾淋巴细胞线粒体肿大,嵴断裂甚至消失,核染色质积聚于核膜下呈环形或团块状;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾的绝对重量、生长指数显著降低(P＜0.05或P＜0.01);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾淋巴细胞的静止期延长,增殖指数明显下降(P＜0.05或P＜0.01);Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾淋巴细胞的凋亡率显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01).证实,日粮铜含量400～800 mg/kg可不同程度地抑制雏鸭脾的发育,导致雏鸭细胞免疫功能和体液免疫功能受损.